Neuronale Stamm- und Vorläuferzellen können sich selbst erneuern und sich in verschiedene neuronale Zelltypen differenzieren, unterstützen die Entwicklung des Nervensystems und bieten eine Ressource für die regenerative Medizin. Diese Zellen sind heterogen, und wir müssen ihre spezifischen Zelloberflächenmarker kennen, um eine gereinigte Zellpopulationen zu erhalten und ihre Funktionen zu verstehen. Unser Protokoll bietet eine einfache, empfindliche und effiziente Technik zur Analyse von Membranproteinen von primären neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen und hilft dabei, neuartige Oberflächenmarker für diese Zellen zu identifizieren.
Der Hauptvorteil unseres Protokolls ist seine Fähigkeit, das Oberflächenproteom von primären neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen mit der verbesserten Empfindlichkeit und Spezifität direkt zu analysieren. Dies wird erreicht, indem sie durch Kokultur innerhalb von Endothelzellen in vitro und hochtractin intrintrinsischen Zellulation MAPK-ERK-Signalweg zur Kennzeichnung von Oberflächenporinen erweitert werden. Mit Poren-Pro-Modifikationen auf expandierende Stammzellen in vitro kann unser Protokoll leicht angewendet werden, um Oberflächenmarker anderer Stammzelltypen zu identifizieren.
Um die Endothelzellen vorzubereiten, setzen Sie ein BEN3-Zellpellet aus einer 10 Zentimeter langen Petrischale bei 90%Konfluzmitzen mit neun Milliliter nBEN3-Zellmedium wieder auf. Fügen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in einen durchlässigen Stützeinsatz ein. Fügen Sie weitere zwei Milliliter BEN3 Medium pro Bohrgut in der unteren Kammer der Matrix hinzu.
Weiter die Zellen für einen Tag bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid zu kulturieren. Einen Tag nach dem Beschichten der Zellen in den Einsätzen, saugen Sie das Medium vorsichtig an, zuerst aus der unteren Kammer und dann aus den Einsätzen. Waschen Sie das Gesicht der Einsätze dreimal mit vorgewärmtem DMEM.
Waschen Sie die Außenfläche der Einsätze durch Spülen mit vorgewärmten DMEM. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter vorgewärmter AM in einen Einsatz ein. Übertragen Sie die Einsätze mit primären kortikalen Zellen in die Brunnen.
Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 12 Stunden. Lösen Sie Ac4ManAz in DMSO auf, um eine Lagerkonzentration von 200 Millimolar zu erreichen. Rufen Sie die neuronal-endotheliale Cokulturplatte aus dem Inkubator ab.
Fügen Sie jeder Unteren Kammer einen Mikroliter des Ac4ManAz-Lagers und 0,5 Mikroliter pro Einsatz in die Co-Kultur hinzu. Kultur die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf Tage. Während die Zellen kultivieren, fügen Sie 100 Mikroliter RM pro Einsatz und 200 Mikroliter RM pro Bodenkammer hinzu, um die Endothel- und Nervenzellen jeden zweiten Tag wieder zu füttern.
Entfernen Sie zunächst die Einsätze von den Co-Kulturplatten und aspirieren Sie das Kulturmedium von der Unterseite der Brunnen. Als nächstes waschen Sie die Nervenzellen einmal mit vorgewärmten PBS. Die PBS aus den Brunnen ansaugen und jeweils einen Milliliter eines vorgekühlten 4%Paraformaldehyds in PBS hinzufügen.
Fixieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgekühlten PBS. Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie jeweils einen Milliliter frisch zubereiteten Biotin konjugierten Puffer 1 in jeden Brunnen ein.
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach den Reaktionspuffer aus den Brunnen ansaugen und die Zellen dreimal mit PBS waschen. Fügen Sie jedem Bohrkörper der Zellen einen Milliliter Färbepuffer hinzu und brüten Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Als nächstes den Färbepuffer aus den Brunnen ansaugen und die Zellen dreimal mit vorgekühltem PBS waschen. Fügen Sie jedem Bohrkörper der Zellen einen Milliliter Sperrpuffer hinzu und brüten Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Sperrpuffer aus den Brunnen und fügen Sie jedem Bohrkörper einen Milliliter Primärantikörperlösung hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung aus den Brunnen. Waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgekühltem PBS.
Aspirieren Sie die PBS aus den Brunnen und fügen Sie jeweils einen Milliliter Sekundärantikörper hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Danach die Lösung aus den Brunnen aspirieren und die Zellen dreimal mit vorgekühltem PBS waschen.
Bereiten Sie zunächst BTTAA-Cupricsulfat-Komplex 2, Vollprotein-Resuspensionspuffer, Proteinwaschpuffer 1, Proteinwaschpuffer 2 und Proteinwaschpuffer 3, wie im Textprotokoll beschrieben, vor. Entfernen Sie als Nächstes die Einsätze von den Co-Kultur-Platten. Das Kulturmedium aus den unteren Brunnen ansaugen und die Nervenzellen einmal mit vorgekühltem PBS waschen.
Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 200 Mikroliter vorgekühlten RIPA-Puffer zu jedem Brunnen. Die Teller fünf Minuten auf Eis bebrüten und dann die Proteinlyse in 1,5 Milliliter-Röhren sammeln. Zentrifuge bei 12000 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die Zellablagerungen zu pellet.
Übertragen Sie den Überstand in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Kit gemäß den Herstelleranweisungen. Passen Sie dann die Proteinkonzentration auf ein Milligramm pro Milliliter an. Fügen Sie 100 Mikromolar-Alkyd-Biotin, 2,5 Millimolar-Natriumascorbat und 1XBTTAA-Cupricsulfat-Komplex 2 bis 1 Milliliter Proteinlyse hinzu.
Mischen Sie die Lösung gut und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde. Danach die Reaktionslösung in 20 Milliliter vorgekühltes Methanol in einem 50 Milliliter konischen Rohr übertragen. Gut mischen und über Nacht bei minus 30 Grad Celsius brüten, um die Proteine auszufällen.
Zentrifugieren Sie bei 4500 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um das Protein auszufällen. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 20 Milliliter n.A. vorgekühltem Methanol pro Wäsche. Als nächstes aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Proteinpellet in vier Millilitern Resuspensionspuffer wieder auf.
Übertragen Sie die Protein-Resuspension in eine neue 15 Milliliter Konustube. Waschen Sie 50 Mikroliter Streptavidin Perlen dreimal mit PBS. Fügen Sie die gewaschenen Perlen in die Protein-Re-Suspension und inkubieren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius für drei Stunden auf einem vertikalen Rotator bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 20 Rpm.
Danach die Perlen sequenziell mit jedem hier gezeigten Waschpuffer waschen. Die gewaschenen Perlen mit 20 MikroliterPBS wieder aufhängen und in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr übertragen. 20 Mikroliter 2X Protein-Ladepuffer hinzufügen und bei 95 Grad Celsius 10 Minuten behandeln.
Dann verarbeiten Sie die Proteinproben mit SDS-PAGE und färben Sie sie mit Coomassie Brilliant Blue, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie werden primäre embryonale NSPCs erweitert und metabolisch in vitro gekennzeichnet. Erfolgreiche endotheliale Co-Kultur führt NSPCs zu großen blattartigen Klonen.
Immunostaining mit Antikörpern zeigt, dass im Klon die meisten Zellen Nestin-positive NSPCs sind, während nur sehr wenige Beta-Tubulin 3 positive neuronale Zellen sind. Im Gegensatz dazu ist der Prozentsatz der Nestin-positiven Zellen und Beta-Tubulin-3-positiven neuronalen Zellen in Klonen, die im Nicht-Kokultursystem gebildet werden, nahezu gleich. Der chemische Reporter Ac4ManAz ist ein metabolisches Analogund und kann in den intrinsischen Protein-Sialylierungsweg integriert werden.
Eine optimierte Etikettierungskonzentration von 100 Mikromolaren für primäre NSPC wird verwendet und eine kombinatorische Auswertung des Zelltodes, die durch Zell- und Kernmorphologie angezeigt wird, legt nahe, dass diese Etikettierungskonzentration keine offensichtlichen zytotoxischen Wirkungen verursacht und nSPCs effizient kennzeichnen kann. Die klonale Morphologie, Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial von NSPCs sowohl im endotheliaalen Kokultur- als auch im Nicht-Kokultursystem sind nicht betroffen. Proteinproben, die aus der Ac4ManAz-gekennzeichneten Kultur durch Biotinkonjugation und Streptavidin-Perlenreinigung hergestellt werden, zeigen ein starkes Coomassie Brilliant Blue Färbesignal in SDS-PAGE Gelen.
In den mit Proteinproben der DMSO-Kontrollgruppe beladenen Bahnen gab es zwischenzeitlich nur Färbehintergrund und unspezifische Bindungssignale. Dies weist auch auf die effiziente Kennzeichnung von NSPCs durch Ac4ManAz hin. Beim Versuch dieses Protokolls sollten alle Lösungen, die für die biozelluläre Reaktion benötigt werden, frisch vorbereitet und die Reaktionszeit streng kontrolliert werden, um eine unzureichende Reaktion zu verhindern.
Nach unserem Protokoll kann die Struktur der Neurostammzell angereicherten Oberfläche Glycan analysiert werden. Unser Protokoll von neuronalen Stamm- und Vorläuferzell angereicherten Oberflächenproteinen erhöht nicht nur Marker, sondern spielt auch wichtige Funktionen auf der erhöhten Musterreinigungsstrategie und der Darstellung von starren Signalschaltungen für diese Zellpopulation.
