Name: cerebellar regional dissection for molecular analysis
Uploaded: 2020-12-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
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Wir danken Austin Ferro und Juao-Guilherme Rosa im Cvetanovic-Labor für ihre Hilfe bei der Fehlerbehebung bei Dissektionen und bei der RNA-Extraktion und RTqPCR. Diese Forschung wird gefördert von M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationale Institute für Gesundheit (NIH).

1. Einrichtung
<ol><li>Sammeln Sie die notwendige Ausrüstung, einschließlich Enthauptungsschere, stumpfe Pinzette, Sezierschere, Gefäßschere, Mikrospatula, sagittale Maushirnmatrix, Rasierklingen, 200 μL Pipettenspitzen, Glassteinschale, Glasobjektträger und Eiskübel. Legen Sie die gesamte Ausrüstung auf einem saugfähigen Pad aus.</li>
	<li>Petrischale, Glasplatte und Gehirnmatrix auf Eis legen.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Rasierklinge in einem senkrechten Winkel etwa 5 mm von der Spitze einer 200 μL-Pipettspitze ab. Dadurch ist die Größe der Öffnung am Ende der Spitze etwa 1 mm breit. Dies sollte ausreichen, um das DCN auszustanzen. Diese kann aber auch je nach Dissektion bedarfsgemäss angepasst werden. Halten Sie viele Tipps für den einfachen Austausch und die Anpassung bereit.</li>
	<li>Etikett 1,5 ml Mikrofugenröhrchen mit Tieridentifikation und Kleinhirnregion (vier Röhrchen pro Tier).</li>
	<li>Füllen Sie den kryosicheren Behälter mit flüssigem Stickstoff, um das Gewebe nach der Extraktion zu flashen.</li>
</ol>2. Gehirnextraktion und Dissektion
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Animal Care Committees der University of Minnesota durchgeführt.
<ol><li>Euthanasiern Sie die Maus mit 5% CO2-Exposition. Sobald die Atmung aufgehört hat, führen Sie eine zervikale Luxation durch. Enthaupten Sie die Maus mit der Enthauptungsschere und entsorgen Sie den Kadaver im entsprechenden Behälter.</li>
	<li>Machen Sie einen Schnitt mit einer Rasierklinge entlang der medialen sagittalen Linie des Kopfes, beginnend an der Nase und den ganzen Weg zurück. Trennen Sie die Haut und trennen Sie sich zu beiden Seiten der Mittellinie. Verwenden Sie die Rasierklinge, um den Muskel auf jeder Seite wegzuschneiden und an den Gehörgängen vorbei zu schneiden.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Schere alle Rückenmarksregionen bis zu dem Punkt, an dem der Hirnstamm auf das Kleinhirn trifft, und achten Sie darauf, das Kleinhirn nicht zu beschädigen.</li>
	<li>Führen Sie eine der vaskulären Scherenklingen in den Raum zwischen Hirnstamm und Wirbelsäule ein und schneiden Sie in Richtung Gehörgang, heben Sie die Schere an, um den Knochen sauber zu schneiden, aber die Schädigung des Gewebes zu begrenzen.</li>
	<li>Schneiden Sie weiter entlang des Schädelrandes in Richtung der Riechkolben und heben Sie sich beim Schneiden weiter an, um die Schädigung des Gehirngewebes zu begrenzen.</li>
	<li>Mit der stumpfen Pinzette die Rückseite des Schädels vorsichtig abziehen und die hintere Region des Gehirns und des Kleinhirns freizulegen.</li>
	<li>Mit der stumpfen Pinzette am Rand des Schädels, der gerade geschnitten wurde, schälen Sie den Rest des Schädels nach oben und über das Gehirn. Dieser Schritt sollte den Großteil der Schädelkappe entfernen und das Gehirn enthüllen.</li>
	<li>Schneiden Sie den Rest des Schädels mit der Gefäßschere und der stumpfen Pinzette ab und entfernen Sie den größten Teil des Schädels von der Oberseite des Gehirns.</li>
	<li>Heben Sie mit der Mikrospatula das Gehirn leicht an und schaufeln Sie darunter und gleiten Sie nach oben, um die Riechkolben vom verbleibenden Schädel zu entfernen und die Fasern des Sehtrakts zu trennen. Das Gehirn sollte an dieser Stelle leicht frei kommen.</li>
	<li>Legen Sie das Gehirn in die Petrischale, die auf Eis sitzt, und entfernen Sie alle verbleibenden Schädel oder andere Trümmer.</li>
	<li>Legen Sie das Gehirn mit der Mikrospatula vorsichtig mit der rückenden Seite nach oben in die Gehirnmatrix. Nehmen Sie sich Zeit, um sicherzustellen, dass es in der Matrix auf Höhe eingestellt ist, insbesondere dass die Mittellinie in der Matrix in der Mitte liegt. Diese Matrix ist für adultes Mausgehirngewebe konzipiert, Gewebe von jüngeren oder erkrankten Tieren kann tiefer in der Matrix ruhen, aber es sollte immer noch möglich sein, reproduzierbare Ergebnisse über Proben hinweg zu erzielen.</li>
	<li>Legen Sie eine Rasierklinge entlang der sagittalen Mittellinie, und stellen Sie sicher, dass die Klinge bis zum Boden der Matrix gedrückt wird (Abbildung 1B).</li>
	<li>Legen Sie eine weitere Rasierklinge 1 mm an die Seite der ersten Klinge (Abbildung 1B). Platzieren Sie zwei weitere Klingen 1 mm voneinander entfernt. Das Endergebnis sollten drei Klingen sein, die auf einer Seite des Gehirns platziert sind, die alle 1 mm voneinander entfernt sind. Tun Sie dasselbe mit der anderen Seite. Insgesamt werden 7 Klingen 1 mm voneinander entfernt platziert (Abbildung 1C).</li>
	<li>Greifen Sie vorsichtig die vorderen und hinteren Enden der Rasierklingen und heben Sie sie gerade aus der Matrix heraus. Das Gewebe an der Außenseite der Rasierklingen kann entsorgt werden.</li>
	<li>Trennen Sie langsam eine Rasierklinge nach der anderen von den anderen und achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte nicht zu beschädigen.</li>
	<li>Schieben Sie den Gewebeteil vorsichtig von der Rasierklinge auf den Glasträger mit der Mikrospatula. Insgesamt wird es sechs sagittale Hirnschnitte geben (Abbildung 1D).</li>
	<li>Bei den 4 seitlichsten Abschnitten ist DCN sichtbar (Violettes Feld, Abbildung 1D). Um das DCN zu isolieren, halten Sie die getrimmte 200 μL-Pipettspitze senkrecht über das DCN und drücken Sie fest durch das Gewebe, wobei Sie in alle Richtungen schaukeln, um das DCN vollständig aus dem umgebenden Gewebe zu sezieren. Heben Sie gerade wieder nach oben, um das DCN sauber zu entfernen, und bestätigen Sie visuell das Vorhandensein des Gewebes in der Spitze.</li>
	<li>Legen Sie einen Finger an die Oberseite der Spitze und drücken Sie nach unten, wodurch sich das Gewebe auswölbt. Legen Sie die Spitze in das korrekt markierte Mikrofugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass der Gewebestempel in den Boden des Röhrchens gelegt wird. Wiederholen Sie 2.17 für die verbleibenden drei Abschnitte und legen Sie die DCN-Stempel in dasselbe Rohr. Legen Sie das Rohr in flüssigen Stickstoff, um es zu gefrieren. Darstellung der Größe jedes Stempels in Abbildung 1E.</li>
	<li>Abschnitte, bei denen DCN extrahiert wurde, gelten als Kleinhirnhemisphäre. Schieben Sie den Rest des Gehirngewebes um das Kleinhirn in diesen Abschnitten weg. Verwenden Sie eine stumpfe Zette und nehmen Sie diese Hemisphären-Kleinhirnrindenabschnitte vorsichtig auf und legen Sie sie in die entsprechende Mikrofugenröhre. Blitzfrost.</li>
	<li>Für die letzten beiden vermalen Abschnitte (hellblauer Kasten, Abbildung 1D)schieben Sie das umgebende Hirngewebe weg und lassen nur das Kleinhirn zurück. Machen Sie mit einer Rasierklinge einen Schnitt, der die vorderen Läppchen von den hinteren Läppchen trennt. Der Schnitt sollte kurz nach der Bildung von Läppchen 6 erfolgen und sollte Läppchen 10 nicht enthalten(Abbildung 1F).</li>
	<li>Legen Sie mit einer stumpfen Handzette die vorderen Kleinhirnkordenabschnitte und die hinteren Kleinhirnrindenabschnitte vorsichtig in ihre jeweiligen Mikrofugenröhrchen und gefrieren Sie blitzgefrieren, indem Sie die Röhrchen 5 Minuten lang in flüssigem Stickstoff belassen. Von hier aus gehen Sie zur RNA-Extraktion über oder können die Röhrchen bei -80 ° C speichern.</li>
</ol>3. RNA-Extraktion 
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde vom Cold Spring Harbor Protocol für die RNA-Extraktion mit TRIzol20 modifiziert. TRIzol löst biologisches Material und ermöglicht die Extraktion von RNA.
<ol><li>Legen Sie die Mikrofugenröhrchen in Eis, um zu verhindern, dass das Gewebe zu schnell auftaut, tragen Sie 150 μL kaltes TRIzol in das Mikrofugenröhrchen auf. Mit einem sterilisierten Stößel homogenisieren. Sobald das Gewebe homogenisiert ist, pipetieren Sie die Lösung nach oben und unten, um sicherzustellen, dass kein verbleibendes Gewebe intakt ist. Brechen Sie kleine Gewebestücke weiter auf, indem Sie sie einige Male in eine Insulinspritze ziehen.</li>
	<li>Fügen Sie weitere 350 μL TRIzol hinzu und pipetieren Sie sie auf und ab, um sie gründlich zu mischen. Lassen Sie die Raumtemperatur für 5 Minuten sitzen.</li>
	<li>150 μL Chloroform in die Tube geben und kräftig schütteln und dann 2-3 Minuten ruhen lassen. Das Chloroform trennt die homogenisierte Gewebelösung in Phasen (RNA, DNA und Protein).</li>
	<li>Zentrifuge bei 12.000 x g, bei 15°C, für 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass sich alle Rohre in der gleichen Ausrichtung befinden.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Röhrchen und stellen Sie die Temperatur der Zentrifuge auf 4°C ein. Entfernen Sie nur die klare bässrige Phase in eine neue Röhre (dies ist die RNA), achten Sie darauf, die undurchsichtige Interphase (die DNA) nicht zu stören.  Die niedrigste Phase ist rot und enthält Protein. Restlösung in den Röhrchen kann gespeichert oder entsorgt werden.</li>
	<li>Fügen Sie 100% Isopropylalkohol im Verhältnis 1:2 hinzu (wenn 200 μL der bässrigen Phase entfernt werden, fügen Sie 100 μL Isopropylalkohol hinzu). Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Der Isopropylalkohol fällt die RNA aus der Lösung aus.</li>
	<li>Zentrifuge bei 12.000 x g, bei 4°C, für 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Rohre in der gleichen Ausrichtung platzieren, um die Visualisierung des Pellets zu erleichtern. Das resultierende Pellet ist die extrahierte RNA.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Rohre, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipett, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Das Pellet ist etwas gelartig und wird schwer zu sehen sein, sollte aber in der Lage sein, abzuschätzen, wo es sich auf der Orientierung der Röhrchen in der Zentrifuge befindet.</li>
	<li>Nachdem Sie den gesamten Überstand entfernt haben, fügen Sie 500 μL 75% Ethanol, Wirbel kurz und Zentrifuge bei 7500 x g, bei 4 ° C, für 5 Minuten hinzu. Das Ethanol wäscht das Pellet weiter.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Lassen Sie die Kappen offen, um die Probe zu trocknen. Dies dauert normalerweise 5-10 Minuten, kann aber variieren, je nachdem, wie viel Ethanol auf dem Pellet übrig geblieben ist. Nicht zu trocken machen.</li>
	<li>Nach dem Trocknen das Pellet in DNase-freiem Wasser wieder auffüllen. Fügen Sie 20 μL zu Proben für DCN und 30 μL für alle anderen hinzu.</li>
	<li>Nach der Wiederaufbeendigung können die Proben bei -80 °C gelagert oder mit weiteren Tests fortgefahren werden.</li>
</ol>4. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RTqPCR)
<ol><li>Vor diesem Schritt wird es notwendig sein, die RNA zu behandeln, um genomische DNA zu entfernen und cDNA mit iScript von BioRad zu generieren. Stellen Sie sicher, dass Sie die Konzentration der RNA normalisieren, bevor Sie die cDNA erstellen. Darüber hinaus ist es wichtig, Primer für qPCR zu optimieren. Befolgen Sie die hier beschriebenen Methoden, um diesen Schritt21abzuschließen. Kurze Beschreibung der qPCR unten.</li>
	<li>Primer werden alle von IDT gekauft. Vorwärts- und Rückwärtssequenzen befinden sich beide im selben Probenröhrchen und werden in 20-facher Konzentration gelagert. Rps18 (Kontrollgen): Vorwärts – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' Rückwärts – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' Parvalbumin (Calciumbindendes Protein, hemmende Zellen): Vorwärts – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Rückwärts – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3' Kcng4 (Untereinheit Kaliumkanal): Vorwärts – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3' Rückwärts – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' Aldolase C (Zebrin II, differentiell über die Kleinhirnrinde exprimiert): Vorwärts – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' Rückwärts – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'</li>
	<li>Die qPCR-Bedingungen waren wie folgt. Vorinkubationszeit, 5 Minuten, bei 95°C. Verstärkungszeit, 50 Zyklen: 10 Minuten bei 95 °C, 10 Minuten bei 62 °C und 10 Minuten bei 72 °C. Schmelzkurvendauer, 5 Sekunden bei 95 °C, eine Minute bei 65 °C und Einstellgeschwindigkeit auf 0,07 °C/Sekunde bis zur Zieltemperatur von 97 °C. Dann Kühlzeit für 10 Minuten auf 40°C.  Alle qPCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und die Genexpression wurde mit 2- ΔΔCt mit Rps18 als Belastungskontrolle analysiert, um die Genexpression zu normalisieren. Bulk-Kleinhirnextrakt wurde als Referenz verwendet.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die zugrunde liegende Genexpression und molekularen Mechanismen innerhalb von vier verschiedenen Kleinhirnregionen zu beurteilen – den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), der vorderen Kleinhirnrinde der Vermis (CCaV), der hinteren Kleinhirnrinde der Vermis (CCpV) und der Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH). Die Fähigkeit, diese Regionen separat zu bewerten, wird unser Wissen über die Heterogenität bestimmter Kleinhirnregionen erweitern und möglicherweise ihren Beitrag zu ve...

Das Kleinhirn enthält mehr als die Hälfte der Neuronen im Gehirn und wurde historisch als motorisches Kontroll- und Gleichgewichtszentrum im Gehirn bezeichnet1. In jüngerer Zeit haben Studien gezeigt, dass das Kleinhirn eine Schlüsselrolle bei verschiedenen anderen Funktionen spielt, einschließlich Kognition, Belohnungsverarbeitung undAffekt 2,3,4,5.
Das Kleinhirn hat eine gut beschriebene Anatomie: Die Kortexregion besteht aus Granula, Purkinje und molekularen Schichten. Körnerzellen bilden die Granulatzellschicht und senden den Input über parallele Fasern an die Purkinje-Zelldendriten der Molekülschicht, die auch Input von Kletterfasern erhalten, die aus der unteren Olive stammen. Purkinje-Zellen senden hemmende Projektionen an Zellen in den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), die als Hauptausgang des Kleinhirns dienen. Die Ausgabe dieses Kleinhirnkreislaufs wird durch die Aktivität der inhibitorischen Interneuronen in der Kleinhirnrinde, einschließlich Golgi-, Stern- und Korbzellen, weiter moduliert4. Diese kleinhirnförmige Funktionseinheit ist über alle Läppchen der Kleinhirnrinde verteilt. Trotz dieser relativ einheitlichen Schaltkreise über das Kleinhirn deuten Beweise aus der Human-Neuroimaging-Literatur und Patientenstudien auf eine funktionelle Heterogenität des Kleinhirnshin 6,7.
Die Kleinhirnrinde kann in zwei Hauptregionen unterteilt werden: die mittelliniendefinierte Vermis und die laterale Hemisphäre. Die Vermis kann weiter in vordere und hintere Läppchen unterteilt werden. Diese unterschiedlichen Regionen des Kleinhirns wurden in die Lage verwickelt, zu unterschiedlichen Verhaltensweisen beizutragen. Aufgaben-evozierte oder aufgabenfreie Aktivitätsmuster implizieren, dass vordere Regionen der Vermis mehr zur motorischen Funktion beitragen, während hintere Vermis mehr zur Kognition beitragen6,7. Die Vermis ist auch mit Affekt und Emotionen verbunden, während Kleinhirnhemisphären zu exekutiven, visuell-räumlichen, sprachlichen und anderen mnemonischen Funktionen beitragen8. Darüber hinaus lieferten anatomische Studien Hinweise darauf, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen mit verschiedenen kortikalen Regionen verbunden sind9. Die Kartierung der Läsionssymptome ergab, dass Patienten mit Schlaganfällen, die die vorderen Läppchen betrafen (bis in das Läppchen VI hinein), eine schlechtere Leistung bei feinmotorischen Aufgaben zeigten, während Patienten mit Schäden an den hinteren Lappenregionen und Hemisphären kognitive Defizite in Abwesenheit des kleinhirnmotorischen Syndromsaufwiesen 10. Schließlich zeigt die regionale Kleinhirnpathologie bei Krankheiten, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen auch unterschiedlich anfällig für Krankheiten sind11,12.
Obwohl viel weniger erforscht, zeigen vorläufige Beweise unterschiedliche Genexpressionssignaturen über zerebelläre kortikale Regionen hinweg. Die Purkinje-Zellexpression von Zebrin II zeigt eine regionsspezifische Musterung in der Vermis, so dass es mehr Zebrin II-positive Zellen in den hinteren Läppchen und weniger in den vorderen Läppchen gibt13. Dies korreliert auch mit einer regional unterschiedlichen physiologischen Funktion, da Zebrin II-negative Purkinje-Zellen eine höhere Frequenz des tonischen Feuerns aufweisen als Purkinje-Zellen, die Zebrin II-positiv sind14.
Neben der Kleinhirnrinde umfasst das Kleinhirn die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die als Primärausgang für das Kleinhirn dienen. Die Kerne bestehen aus den medialen (MN), interposierten (IN) und lateralen Kernen (LN). Funktionelle Bildgebung und Patientenstudien haben gezeigt, dass das DCN auch an verschiedenen Verhaltensweisen beteiligt ist15, aber nur sehr wenige Studien untersuchen die Veränderung der Genexpression in DCN.
Fortschritte in molekularen Techniken haben es ermöglicht, die regionale Genexpression im Gehirn zu beurteilen und haben Heterogenität zwischen und innerhalb verschiedener Gehirnregionen sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen aufgedeckt16. Solche Studien implizieren, dass sich das Kleinhirn von anderen Gehirnregionen unterscheidet. Zum Beispiel ist das Verhältnis von Neuronen zu Gliazellen im Kleinhirn im Vergleich zu anderen Hirnregionen invertiert1. Selbst unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Expression von proinflammatorischen Genen im Kleinhirn im Vergleich zu den anderen Hirnregionen hochreguliert17. Molekulare Techniken waren auch sehr nützlich bei der Identifizierung der Wege, die zur Pathogenese von Kleinhirnerkrankungen beitragen. Zum Beispiel identifizierte die RNA-Sequenzierung der gesamten Kleinhirnextrakte Gene, die in einem Purkinje-zellspezifischen transgenen Mausmodell der spinozerebellären Ataxie Typ 1 (SCA1) im Vergleich zu ihren Wildtypkontrollen verändert wurden. Solche Beweise haben wichtige molekulare Wege aufgedeckt, die der Pathogenese in kleinhirnen Purkinje-Zellen zugrunde liegen, und haben dazu beigetragen, potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren18. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass es Unterschiede in der Anfälligkeit für Krankheiten in den Kleinhirnregionen gibt11,12,19. Dies könnte darauf hindeuten, dass es in verschiedenen Kleinhirnregionen zu wichtigen Veränderungen kommt, die mit ganzen Kleinhirnextrakten maskiert oder unentdeckt sein können. Daher müssen Techniken entwickelt werden, die es Forschern ermöglichen, molekulare Profile in verschiedenen Kleinhirnregionen zu untersuchen.
Die hier vorgeschlagene Technik beschreibt eine reproduzierbare Methode, um vier verschiedene Regionen des Kleinhirns der Maus zu sezieren, um RNA aus diesen Regionen zu isolieren und regionale Unterschiede in der Genexpression zu untersuchen. Das Schema des Kleinhirns der Maus in Abbildung 1A hebt die Vermis in Blau und die Hemisphären in Gelb hervor. Insbesondere ermöglicht diese Technik die Isolierung von vier Regionen: tiefe Kleinhirnkerne (DCN) (rot gepunktete Kästchen in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der vorderen Vermis (CCaV) (dunkelblau in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der hinteren Vermis (CCpV) (hellblau in Abbildung 1A)und die Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH) (gelb in Abbildung 1A). Durch die getrennte Beurteilung der Genexpression dieser Regionen wird es möglich sein, molekulare Mechanismen zu untersuchen, die den diskreten Funktionen dieser verschiedenen Regionen zugrunde liegen, sowie mögliche Unterschiede in ihrer Anfälligkeit für Krankheiten.

<table><tbody><tr><td>1.5 Microcentrifuge tubes</td><td>ThermoScietific</td><td>3456</td><td></td></tr><tr><td>100% Isopropyl Alcohol</td><td>VWR Life sciences</td><td>1106C361</td><td></td></tr><tr><td>200 ul Pipet tips</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-200</td><td></td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RBMA-200S</td><td></td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron</td><td>220905</td><td></td></tr><tr><td>Decapitation Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide (for electrophoresis)</td><td>BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Kimble</td><td>6HAZ6</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringe (.5ml)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td><td>BIORAD</td><td>1725037</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle Nose forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Aldolase C</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58&gt;43415246</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Kcng4</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.56a.9448518</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Parvalbumin</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.7596729</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer Rps18&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.12109666</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Rzor Blades</td><td>Personna GEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile, sigle-use pestles</td><td>FisherScientific</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion by Life technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Kleinhirn spielt eine wichtige Rolle in mehreren Schlüsselfunktionen, einschließlich der Kontrolle von Bewegung, Gleichgewicht, Kognition, Belohnung und Affekt. Bildgebende Untersuchungen deuten darauf hin, dass unterschiedliche Kleinhirnregionen zu diesen verschiedenen Funktionen beitragen. Molekulare Studien, die regionale Kleinhirnunterschiede untersuchen, hinken hinterher, da sie meist an ganzen Kleinhirnextrakten durchgeführt werden, wodurch alle Unterscheidungen zwischen bestimmten Kleinhirnregionen maskiert werden. Hier beschreiben wir eine Technik, um vier verschiedene Kleinhirnregionen reproduzierbar und schnell zu sezieren: die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die vordere und hintere vermale Kleinhirnrinde und die Kleinhirnrinde der Hemisphären. Die Sezierung dieser unterschiedlichen Regionen ermöglicht die Erforschung molekularer Mechanismen, die ihren einzigartigen Beiträgen zu Gleichgewicht, Bewegung, Affekt und Kognition zugrunde liegen können. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der pathologischen Anfälligkeit dieser spezifischen Regionen in verschiedenen Mauskrankheitsmodellen zu untersuchen.

Für diese Experimente wurden vier elf Wochen alte weibliche Wildtyp-C57/Black6-Mäuse verwendet. Eine Maus wurde verwendet, um eine vollständige Kleinhirndissektion durchzuführen, die als "Bulk-Kleinhirn" bezeichnet wird und den Vergleich der RNA-Spiegel in sezierten Regionen mit einer vollständigen Dissektion ermöglichte. Die anderen drei Mäuse wurden verwendet, um die in diesem Protokoll beschriebene Kleinhirndissektion durchzuführen. Durch den Einsatz von drei Mäusen kann siche...

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Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Verschiedene Kleinhirnregionen spielen eine Rolle bei unterschiedlichen Verhaltensergebnissen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bleiben unbekannt. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Kleinhirnrinde der Hemisphären, der vorderen und hinteren Regionen der Vermis und der tiefen Kleinhirnkerne reproduzierbar und schnell zu sezieren, um durch Isolierung von RNA und Tests auf Unterschiede in der Genexpression auf molekulare Unterschiede zu untersuchen.

Zerebelläre regionale Dissektion für die molekulare Analyse

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.0K Aufrufe.  University of Minnesota. Verschiedene Kleinhirnregionen spielen eine Rolle bei unterschiedlichen Verhaltensergebnissen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bleiben unbekannt. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Kleinhirnrinde der Hemisphären, der vorderen und hinteren Regionen der Vermis und der tiefen Kleinhirnkerne reproduzierbar und schnell zu sezieren, um durch Isolierung von RNA und Tests auf Unterschiede in der Genexpression auf molekulare Unterschiede zu untersuch...

Serie: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Wholemount Immunhistochemie für die Aufdeckung von komplexen Gehirn Topographie

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

Isolation von unterschiedlichen Zellpopulationen aus sich entwickelnden Kleinhirn durch Mikrodissektion

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex (mPFC) or nucleus accumbens. The challenge in this work is to dissect the correct area while preserving the microenvironment to be examined. In this paper, we describe a simple, low-cost method using resources readily available in most labs. This method preserves nucleic acid and proteins by keeping the tissue frozen throughout the process. Brains are cut into 0.5&#8211;1.0 mm sections using a brain matrix and arranged on a frozen glass plate. Landmarks within each section are compared to a reference, such as the Allen Mouse Brain Atlas, and regions are dissected using a cold scalpel or biopsy punch. Tissue is then stored at -80 &#176;C until use. Through this process rat and mouse mPFC, nucleus accumbens, dorsal and ventral hippocampus and other regions have been successfully analyzed using qRT-PCR and Western assays. This method is limited to brain regions that can be identified by clear landmarks.

This procedure describes the collection of discrete frozen brain regions to obtain high-quality protein and RNA using inexpensive and commonly available tools.

Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

Mikrodissektion des Mausgehirns in funktionell und anatomisch unterschiedliche Regionen

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

Kryoschnitt-Dissektion der adulten subependymalen Zone für genaue und tiefe quantitative Proteomanalyse

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

Eine standardisierte Pipeline zur Untersuchung der Morphometrie der menschlichen zerebellären grauen Substanz mittels struktureller Magnetresonanztomographie

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Kleinhirn-Purkinje-Zellen: DNA-Schadensreaktion in organotypischen Kulturen

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional activity, making them particularly vulnerable to DNA damage. This necessitates an efficient DNA damage response (DDR) to prevent cerebellar degeneration, often initiated by PC dysfunction or loss. A notable example is the genome instability syndrome, ataxia-telangiectasia (A-T), marked by progressive PC depletion and cerebellar deterioration. Investigating DDR mechanisms in PCs is vital for elucidating the pathways leading to their degeneration in such disorders. However, the complexity of isolating and cultivating PCs in vitro has long hindered research efforts. Murine cerebellar organotypic (slice) cultures offer a feasible alternative, closely mimicking the in vivo tissue environment. Yet, this model is constrained to DDR indicators amenable to microscopic imaging. We have refined the organotypic culture protocol, demonstrating that fluorescent imaging of protein-bound poly(ADP-ribose) (PAR) chains, a rapid and early DDR indicator, effectively reveals DDR dynamics in PCs within these cultures, in response to genotoxic stress.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Rolle von ATM bei Ataxie-Teleangiektasie und der damit verbundenen Kleinhirndegeneration

Cerebellar Purkinje cells (PCs) are particularly sensitive to deficiencies in the DNA damage response. A protocol is presented for the visual evaluation of the dynamics of PC response to DNA damage, which involves staining protein-bound poly(ADP-ribose) chains within cerebellar organotypic cultures.