Diese Methode hilft, die zytotoxische Aktivität verschiedener Zelltypen mit einer einfachen, kostengünstigen Methode zu vergleichen, die keine spezielle Ausrüstung erfordert. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie nicht die Verwendung von gefährlichen Materialien erfordert, es ist kostengünstig, und erfordert nicht die Verwendung von spezialisierten Geräten. Diese Methode kann angewendet werden, um die zytotoxische Aktivität anderer Zelltypen wie CD8 plus zytolytische Zellen zu messen oder sogar den spontanen Tod von Zellen ohne Inkubation, ohne zytolytische Effektorzellen zu bewerten.
Personen, die neu in dieser Technik haben, werden wahrscheinlich mit der Optimierung des Ziel-Effektor-Zell-Verhältnisses zu kämpfen haben. Mein Rat ist, eine gründliche Suche in der Literatur zu tun, um die Verhältnisse zu bestimmen, die Sie testen würden, wenn Sie das Protokoll optimieren. Obwohl diese Methode keine speziellen Fähigkeiten erfordert, abgesehen von der präzisen Pipettierung, sind die Isolierung von mononukleären Zellen und die Einrichtung der Assayplatte Schritte, die leichter verstanden und nachgeahmt werden können, wenn sie visuell beobachtet werden.
Demonstriert wird das Verfahren von Chelsea Jekelley, einer Technikerin aus meinem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie 13,5 Milliliter RPMI in 1,5 Milliliter FBS zu einer Petrischale hinzu, die einen 100-Mikrometer-Filter enthält. Legen Sie eine Plazenta auf den Filter und verwenden Sie die flache Seite eines Spritzenkolbens, um ihn durch den Filter und in die Petrischale zu schieben.
Als nächstes legen Sie drei 15-Milliliter konische Röhren für jedes Gewebe. Fügen Sie drei Milliliter Dichte Gradient medium zu jedem Rohr, und langsam überlagern fünf Milliliter homogenisierte Plazenta in jedem Rohr. Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für 25 Minuten ohne Pause.
Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um die dünne weiße Buffy-Schicht zu sammeln. Fügen Sie 10 Milliliter RPMI zu den kombinierten Buffy-Layern hinzu. Zentrifuge bei 300 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und den Überstand entsorgen.
Zuerst das Zellpellet in 50 Mikroliter eiskaltem PBS wieder aufhängen. Fügen Sie biotin-markierte CD3-Antikörper nach dem Herstellerprotokoll hinzu und mischen Sie sie gut mit einer Pipette. Legen Sie das Rohr in einen Rohrrotator und inkubieren Bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Fügen Sie als Nächstes einen Milliliter RPMI hinzu. Zentrifuge bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI wieder auf.
Kombinieren Sie die Zellsuspension mit 150 Mikrolitermagnetperlen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Übertragen Sie das Rohr auf einen Rohrrotator und drehen Sie während der Inkubation bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Rufen Sie während der Inkubation den Freigabepuffer ab und lassen Sie ihn in einem Bio-Sicherheitsschrank Raumtemperatur erreichen.
Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, legen Sie das Rohr für eine Minute in den Magneten. Sammeln Sie den Überstand und speichern Sie die CD3 negative Zellpopulation in einem 15 Milliliter Rohr auf Eis. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten, fügen Sie einen Milliliter RPMI hinzu und verwenden Sie eine Pipette, um die Zellen und Perlen fünfmal zu mischen.
Legen Sie das Rohr dann für eine Minute wieder in den Magneten. Sammeln Sie den Überstand und speichern Sie die CD3 negative Population in einem 15 Milliliter Rohr auf Eis. Zentrifugieren Sie die CD3-negative Population der Zellen bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in 50 Mikroliter eiskaltem PBS wieder auf. Danach, biotin-markierte CD161A Antikörper zu den CD3-Negativzellen hinzufügen, nach den Anweisungen des Herstellers und gut mischen. Legen Sie das Rohr in einen Rohrrotator und inkubieren Bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Als nächstes fügen Sie einen Milliliter RPMI und Zentrifuge bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten hinzu. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI wieder auf und kombinieren Sie es mit magnetischen Perlen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Legen Sie das Rohr in Rohrrotator und drehen Sie während der Inkubation bei vier Grad Celsius für 30 Minuten.
Legen Sie dann das Rohr für eine Minute in den Magneten. Sammeln Sie den Überstand und verwerfen Sie CD3 negative CD161A negative Zellen. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten, fügen Sie einen Milliliter RPMI hinzu und mischen Sie es gut.
Legen Sie das Rohr für eine Minute in den Magneten, stellen Sie sicher, dass sie den Überstand sammelt und die CD3-negativen CD161A-Negativzellen entsorgt. Danach entfernen Sie das Rohr vom Magneten und fügen Sie einen Milliliter Raumtemperatur-Freigabepuffer hinzu. Legen Sie das Rohr auf einen Rohrrotator und drehen Sie während der Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Als nächstes legen Sie das Rohr für eine Minute in den Magneten. Sammeln Sie den Überstand in einer neuen 15-Milliliter-Konikonröhre auf Eis. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten, fügen Sie einen Milliliter Raumtemperatur RPMI hinzu und mischen Sie es gut.
Legen Sie das Rohr für eine Minute wieder unter den Magneten, um den Überstand in der gleichen 15-Milliliter konischen Röhre zu sammeln. Mischen Sie gut und nehmen Sie eine 20-Mikroliter-Probe, um die Zellen zu zählen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in RPMI erneut aus. Säen Sie die Zellen in eine sechs Brunnenplatte mit einer Konzentration von 300.000 Zellen pro Brunnen in 2,5 Milliliter NK-Zellaktivierungsmedien. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator für 48 Stunden.
Verwenden Sie in einer Kapuze eine serologische Pipette, um YAC1-Zellen in Medien auf eine 50-Milliliter-Röhre auf Eis zu übertragen und gut zu mischen. Nehmen Sie einen 20 Mikroliter Aliquot, um die Zellen zu zählen. Drehen Sie die Zellen bei 300 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Mit einer serologischen Pipette, sammeln Sie den Überstand aus der zuvor vorbereiteten NK-Zelle sechs Brunnenplatte in 15 Milliliter konische Röhre. Fügen Sie dann Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzu. Tippen Sie auf die Platte und legen Sie sie bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator.
Nachdem die Zellen mit Trypsin EDTA für etwa fünf Minuten inkubiert haben, verwenden Sie einen sterilen Plattenkratzer, um die Platte zu kratzen. Fügen Sie dann jedem Brunnen einen Milliliter NK-Zellmedien hinzu. Mit einer serologischen Pipette die Zellen und Medien sammeln und in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen.
Nehmen Sie einen 20 Mikroliter Aliquot, um die Zellen zu zählen. Zentrifugieren Sie die NK-Zellen bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Erstens, erhalten Sie eine runde Unterseite, Kultur behandelt 96 gut Platte und richten Sie es wie in Tabelle eins des Textprotokolls beschrieben.
Zentrifugieren Sie die Assayplatte bei 250 mal G für vier Minuten, um sicher zu sein, dass der Effektor und die Zielzellen in Kontakt sind. Als nächstes inkubieren Sie die Platte in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf Stunden. 45 Minuten vor der Ernte der Überwälte 10 Mikroliter 10-fache Lyselösung in die Zielzelle geben, die maximale LDH-Freisetzungsbrunnen freisetzt, und die Platte in die befeuchtete Kammer zurückgeben.
Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Platte bei 250 mal G für vier Minuten, dann verwenden Sie einen Mehrkanal-Pipetter, um 50 Mikroliter-Aliquots von jedem Brunnen auf eine frische 96-Well, flache Boden-Assay-Platte zu übertragen. Fügen Sie 50 Mikroliter Assay-Reagenz in jeden Brunnen der Assayplatte. Bedecken Sie die Platte mit Folie, um sie vor Licht zu schützen und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang zu bebrüten.
Danach fügen Sie 50 Mikroliter Stop Solution zu jedem Brunnen hinzu. Achten Sie darauf, die Platte innerhalb einer Stunde nach dem Hinzufügen der Stop-Lösung zu lesen und die Absorption bei 490 Nanometern aufzuzeichnen. Plazenta-NK-Zellen, die von NP- und RUPP-Ratten gewonnen werden, werden fünf Stunden lang mit Zielzellen in ihren jeweiligen Medien im Verhältnis 50:1 inkubiert.
Die mit 490 Nanometern aufgezeichneten Rohabsorptionsdaten werden hier gezeigt. Die durchschnittliche Absorption des kulturellen Mediums Hintergrund und der Volumenkorrektur-Kontrollbrunnen werden berechnet, und diese Durchschnittswerte werden von den entsprechenden Brunnen subtrahiert, die im Herstellerprotokoll angegeben sind. Die korrigierten Werte werden dann verwendet, um die Zytotoxizität mit dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll zu erhalten.
Obwohl diese Methode keine speziellen Fähigkeiten erfordert, abgesehen von der präzisen Pipettierung, sind die Isolierung von mononukleären Zellen und die Einrichtung der Assayplatte Schritte, die leichter verstanden und nachgeahmt werden können, wenn sie visuell beobachtet werden. Nach der Isolierung der NK-Zellen könnten eine Reihe anderer Verfahren durchgeführt werden, wie z. B. Co-Kultur-Experimente, um die Rolle der plazentischen NK-Zellen bei der Zuordnung zur Trophoblastenmigration während der Schwangerschaft zu bestimmen. Wir sammeln auch die Medien aus den erweiterten NK-Zellen, um Zytokinase zu bewerten, die von den differenziell stimulierten Zellen abgesondert wird.
Die Reinheit der isolierten Zellen konnte auch über die Durchflusszytometrie beurteilt werden.
