Diese Assay-Methodik ist ein großer Fortschritt im Wissen über die Zellimmunität gegen Malaria im Blutstadium und trägt dazu bei, neue therapeutische Ziele zu entdecken und den Fortschritt des Malaria-Impfstoffs zu beschleunigen. Die Etablierung eines Plasmodium-in-vitro-Assays, der für menschliche oder tierische Proben verwendet werden kann, ist wertvoll für ein besseres Verständnis der Malaria-Pathogenese. Die schützende Immunität gegen Malaria ist noch nicht vollständig geklärt.
Für die Entwicklung neuer Therapien ist es wichtig, die Mechanismen der Zellimmunität gegen das parasitäre Stadium der Malaria zu erforschen. Das Verfahren wird von mir, Luna de Lacerda, und Christopher Gomes, einem Studenten aus Carolines Labor, demonstriert. Saugen Sie zunächst 100 Mikroliter Heparinlösung mit einer 26-Gauge-Nadel in eine Ein-Milliliter-Spritze.
Legen Sie die Maus auf die Seite und führen Sie die Nadel senkrecht direkt unter dem Ellbogen durch die Rippen und in das Herz ein. Ziehen Sie den Spritzenkolben langsam heraus und drehen Sie die Nadel, bis 0,5 bis ein Milliliter Blut gewonnen wird. Reinigen Sie die linke Seite der Maus aseptisch mit 70%igem Ethanol.
Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt auf der linken Seite der Maus, der durch die Haut und das Bauchfell führt. Suchen Sie die Milz und entfernen Sie sie. Legen Sie die Mausmilz in eine Petrischale mit fünf Millilitern Vollmedium, um die gewünschte Effektorzellpopulation zu reinigen.
Über ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen wird ein 100-Mikromolarzellsieb gelegt und die exzidierte Milz mit einer anatomischen Pinzette in das Zellsieb überführt. Die Milz mit einem Spritzenkolben durch das Sieb zerdrücken. Waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern Komplettmedium durch das Sieb.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Milliliter kalten Erythrozylysepuffer und inkubieren Sie die Suspension fünf Minuten lang auf Eis.
Waschen Sie die Zellsuspension mit 10 Millilitern Vier-Grad-Celsius-Komplettmedien und entfernen Sie alle Zellgerinnsel zwischen den Haarwäschen für Milz von Plasmodium-infizierten Mäusen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie dann den Überstand.
Legen Sie nun eine LS- oder LD-Säule in das Magnetfeld und bereiten Sie die Säule vor, indem Sie sie mit drei Millilitern MACS-Puffer spülen. Tragen Sie als Nächstes die Zellsuspension auf die Säule auf. Nach dreimaligem Waschen der Säule mit drei Millilitern MACS-Puffer wird der Durchfluss mit den Milzzellen aufgefangen.
Ernten Sie 10 Mikroliter der Milzzellen und fügen Sie 10 Mikroliter Trypanblau hinzu, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen. Geben Sie die Zellen in das Hämozytometer. Zählen Sie die Splenozyten in einer Trypanblau-Lösung und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen.
Zentrifugieren Sie alle Milzzellen und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 40 Mikrolitern MACS-Puffer. 10 Mikroliter eines Biotin-Antikörper-Cocktails in die Zellen geben, gut mischen und fünf Minuten auf Eis inkubieren.
Nachdem Sie die Anti-Biotin-Mikrokügelchen 10 Minuten lang auf Eis inkubiert haben, legen Sie die MACS LS-Säule in den Magnetfeldträger und bereiten Sie die Säule vor, indem Sie sie mit drei Millilitern MACS-Puffer spülen. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern MACS-Puffer und sammeln Sie den Durchfluss mit allen unmarkierten zytotoxischen Zellen.
Nachdem Sie das entnommene Blut fünf Minuten lang mit dem 350-fachen G zentrifugiert haben, verwerfen Sie das Serum und resuspendieren Sie das Blut in einem Milliliter RPMI ohne FBS. Nachdem Sie die LS-Säule in die Magnetfeldhalterung eingesetzt haben, spülen Sie sie mit RPMI und führen Sie die RBC-Suspension durch die Säule. Sobald die Zellen die Säule durchlaufen haben, zentrifugieren Sie den Durchfluss, verwerfen Sie den Überstand und geben Sie einen Milliliter des Durchflusses erneut in die Säule, um weitere iRBCs zu isolieren.
Waschen Sie die Säule zweimal mit fünf Millilitern RPMI. Führen Sie Waschschritte durch, indem Sie Pufferaliquots hinzufügen, sobald das Säulenreservoir leer ist. Fügen Sie fünf Milliliter RPMI hinzu, entfernen Sie die Säule und spülen Sie die iRBCs in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.
Verdünnen Sie einen Mikroliter einer 10-millimolaren CFSE-Lösung in einem Milliliter RPMI ohne FBS. Nach der Resuspendierung der Erythrozyten in 500 Millilitern RPMI ohne FBS 500 Milliliter des verdünnten CFSE zugeben und acht Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 14 Millilitern Vollmedium und zentrifugieren Sie die Zellen zweimal.
Für die zytotoxische Lymphozyten-Cokultur werden die Zellen in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden plattiert. Die gereinigten Lymphozyten und CFSE-markierten iRBCs im gewünschten Effektor-/Zielzellverhältnis auf ein Endvolumen von 200 Millilitern geben und homogenisieren. Bereiten Sie jede Bedingung in dreifacher Ausführung vor und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius.
Die iRBCs wurden aus P.yoelii-infizierten Mäusen mittels LS-Säulen aufgereinigt. Die Reinigung wird durch Blutausstriche von Blutausstrichen hervorgehoben, die vor und nach der Säulenanreicherung entnommen wurden. Die Gating-Strategie, die zur Beurteilung des prozentualen Anteils der Erythrozytenlyse erforderlich ist, wird hier vorgestellt.
Das Stopptor wird in die Zählperlenpopulation gesetzt. Die Gating-Strategie beginnt mit der Auswahl der einzelnen Zellen, mit Ausnahme von Trümmern, basierend auf dem Verhältnis von Forward-Scatter-Peak-Höhe zu Fläche, gefolgt von der Selektion der RBC-Population in Ter119+ und CD8-Selektion. Hier ist die Analyse, die auf ein experimentelles Beispiel angewendet wird, bei dem verschiedene Effektoren-Ziel-Verhältnisse verwendet werden, wobei lebende Erythrozyten nach der Co-Kultur angezeigt werden.
Es wird eine grafische Darstellung des Erythrozyten-Lyseprozentsatzes gezeigt, der auf der Grundlage dieser Formel berechnet wird. Die Signifikanz zwischen den Gruppen, die zytotoxisches CD8 oder naives CD8 verwendeten, wurde mittels zweifacher ANOVA mit Mehrfachvergleichen ermittelt. Die aktuelle Methode erforscht die Lyse von Erythrozyten durch direkten Zellkontakt mit Killerzellen, und es kann geplant werden, die beteiligten Mechanismen aufzudecken, indem Antikörper gegen bestimmte Rezeptoren oder Moleküle blockiert werden.
Dieser In-vitro-Tötungstest stellt eine neuartige Strategie zur Aufklärung der Mechanismen der zellvermittelten Immunität gegen Malaria im Blutstadium dar, die den Fortschritt neuer Malariatherapien und -impfstoffe unterstützen wird.
