Die Arbeit wurde durch Zuschüsse aus Helse og Rehabilitering (JLB), The Norwegian Research Council (GH und GBG) und der Universität von Oslo (NK und GBG) unterstützt.

1. Isolierung und Kultivierung von humanen Stammzellen und die Vorbereitung für die Injektion in Embryonen <ol><li> Menschliche Stammzellen als Beispiele in diesem Protokoll (Gehirn, Fettgewebe, Knochenmark) verwendet werden, in unterschiedlicher Weise von den verschiedenen Geweben isoliert. Zum Beispiel sind adulten neuralen Stammzellen aus Gewebe Stücke aus der Ventrikelwand des Gehirns bei der endoskopischen Neurochirurgie, die dann dissoziiert einzelnen Zellen, die in vitro kultiviert werden gesammelt isoliert. Die neuralen Stammzellen spontan Neurosphären, dass in dem Kulturmedium schwimmen, während andere Zelltypen auf den Boden der Schale 7 einhalten. Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen werden aus Fettabsaugung Material, das enzymatisch verdaut und strengte sich an faserige Gewebe zu entfernen und anschließend zentrifugiert, um zu reifen Fettzellen zu entfernen. Die erhaltenen Zellen werden in Kulturmedium mit Serum ergänzt, um die Proliferation von Stammzellen zu fördern gegenüber anderen Zelle Typen 8 hämatopoetische Stamm-und Vorläuferzellen aus dem Knochenmark saugt durch positive Selektion mittels spezifischer Antikörper, konjugiert mit magnetischen Partikeln (Myltenyi Biotec, Deutschland isoliert werden resuspendiert oder Dynal-Invitrogen, USA) und magnetische Zellseparation, und / oder mit Hilfe von Antikörpern, konjugiert mit Fluorophore und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) 9. </li><li> Um eine spätere Identifizierung, beschriften Sie die Stammzellen mit einem fluoreszierenden Marker vor der Implantation in Hühnerembryonen zu erleichtern. Stammzellen können mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen wie DiI (Invitrogen, USA) oder PKH26 (Sigma, USA) mit Lieferanten empfohlenen Protokolle bis kurz vor der Implantation, oder für eine dauerhafte Beschriftung mit im Wesentlichen keine Gefahr der Kontamination Wirtszellen, gekennzeichnet sie können mit dem Gen für ein fluoreszierendes Protein wie Green Fluorescent Protein transduziert werden, mit lentiviralen Vektoren, während noch in der Kultur 10. </li><li> Protokolle für die Kultur und Vermehrung von menschlichen Stammzellen unterscheiden. Detaillierte Protokolle können in der Literatur gefunden werden. Kurz gesagt, sind Kugel-bildenden Stammzellen in der Regel in Flaschen gezüchtet, während Anhänger Stammzellen in der Regel in Petrischalen kultiviert werden (was zu erleichtern Verreibung beim Aufteilen, siehe unten), in geeigneten Medium. Für die Spaltung oder Ernte-, Pellet-Kugel-bildenden Zellen durch 5 min Zentrifugation bei 1200rpm und resuspendieren in vorgewärmten Trypsin / EDTA-Lösung für nicht mehr als 5 min bei 37 Grad Celsius. Für adhärente Zellen fügen Sie die Trypsin / EDTA-Lösung auf die Petrischale, und verreiben am Ende der 5 Minuten. Beenden Sie die Trypsinierung durch Zugabe von Ca 2 +-haltigem Medium, manchmal mit Albumin ergänzt. Zum Entfernen der Trypsin / EDTA, Zentrifuge die Zellen (5 min bei 1200rpm), entfernen Sie den Überstand resuspendieren in kalten Injektion Fahrzeug (in der Regel mittel-oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) und Zentrifuge wieder (5 min bei 1200rpm). Entfernen Sie die meisten dieser Überstand und sanft resuspendieren einer hochkonzentrierten Zellsuspension zu schaffen. </li><li> Halten Sie die Aussetzung des menschlichen Stammzellen in einem kleinen, verschlossenen Röhrchens oder Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis bis zu mehreren Stunden vor der Injektion. Überleben in diesem Zustand kann Zelltyp-abhängig. Die Injektion Fahrzeug muss nach den Eigenschaften der Zellen optimiert werden, einschließlich ihrer Haftfähigkeit (zB eine low-Ca 2 + Fahrzeug kann helfen zu verhindern Verklumpung) und Resistenz gegenüber Hypoxie und pH-Änderungen. </li></ol> 2. Egg Inkubation und Vorbereitung <ol><li> Shop befruchteten Eier in eine Kühlkammer (zum Beispiel: Termaks, Bergen, Norwegen) bei 14-15 ° C vor der Inkubation. Bei dieser Temperatur Entwicklung wird verhaftet, bis Inkubationszeit beginnt. Befruchteten Eier für mehr als 10 Tagen oder bei niedrigeren Temperaturen gelagert haben eine niedrigere Rate von späteren Entwicklung und das Überleben. </li><li> Um reinitiate Entwicklung, die Eier in einer befeuchteten, Gebläse Inkubator (zum Beispiel: Binder, New York, USA) bei 38-39 ° C, und inkubieren, bis die gewünschte Stufe der Entwicklung erreicht ist (für die Inszenierung, siehe Lit. 11. ). </li><li> Vor dem Öffnen der Eier, schaffen ein Luftpolster über der Embryo durch Einfügen einer 18-Gauge-Kanüle durch die Eierschale (nicht zu tief zu vermeiden piercing das Eigelb) und Evakuieren 4 ml Albumin (Abbildung A). Dadurch entsteht ein Druckabfall, der innerhalb von wenigen Minuten durch den Eintrag von Luft durch die poröse Schale ausgeglichen ist. Da die Luft gelangt es sammelt sich am höchsten Punkt in der Schale, also die Trennung der Embryo von der inneren Oberfläche der Schale. </li><li> Dichten Sie das Loch durch die Nadel der Spritze mit herkömmlichen Kunststoff-Band geschaffen. </li></ol> 3. Pulling Glasmikropipetten <ol><li> Pull Glasmikropipetten aus Borosilikatglas (z. B. 1,2 mm OD x 0,94 mm ID, Harvard Apparatus, USA) auf einem herkömmlichen Elektrode Abzieher (z. B. Modell P-2000, Sutter Instruments, USA). Passen Sie puller Einstellungen Mikropipetten, dass hohen Eingangswiderstand haben, wenn sie als microel verwendet zu erhaltenectrodes. Tipps sollten ca. 1-1,5 cm lang. Die Wellen können bei 1 mm Abstand zur Berechnung Volumen ausgeworfen markiert werden. </li><li> Break the Mikropipettenspitzen eine praktikable Größe durch Biegen sie mit einer Pinzette oder schob sie gegen eine feste Oberfläche, während Sie unter dem Mikroskop. Die Pause sollte so gleichmäßig wie möglich sein um den Umfang des Glases und der daraus resultierenden inneren Durchmesser an der Spitze sollte die Größe der Zellen an, ohne sich verstopft werden unterzubringen. In der Regel eine 20-30 Mikrometer Innendurchmesser gut funktioniert. </li></ol> 4. Vorbereitung der Fast Green Farbstofflösung (Kontrast-Reagenz) <ol><li> Bereiten Sie eine 0,1% (w / v) Lösung von Fast Green-Farbstoff (Sigma-Aldrich, USA) durch Auflösen in Huhn physiologischer Kochsalzlösung (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na- Phosphat, 5 mM HEPES, 11 mM Glucose, pH 7,4). </li><li> Filter der Fast Green-Lösung durch ein 0,22 um Millex GP-Filter (Millipore Co., Bedford, USA). </li></ol> 5. Das Öffnen der Eier und Kontrast des Embryos <ol><li> Legen Sie zwei Klebestreifen an der Oberseite des Eies, für die Dimensionen der Luftblase. Keeping the egg so ausgerichtet, dass die aufgenommene Fläche (und damit die Luftblase) oberste ist, schneiden Sie ein kleines Fenster innerhalb der Grenzen der Naht mit einem stabilen Dissektion Schere. Die Band bietet Unterstützung und hilft zu verhindern, Eierschale Fragmente fallen auf den Embryo. Luftblasen mit dem Luftpolster verbunden sind, können knallte mit dem hinteren Ende eines Kunststoff-Pipettenspitze oder einem anderen stumpfen Sonde werden. </li><li> Zeichnen Sie einige Fast Green-Lösung in einer 1 ml Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze und der Nadel. Biegen Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel, an einem Punkt außerhalb der embryonalen Platte (erkennbar durch den Ring von Blutgefässen, die es zu umschreiben; Piercing in der embryonalen Platte erhöht Sterblichkeit) eindringen und sorgfältig führen die Nadelspitze unter der Embryo. Inject der Farbstoff, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist. Der Embryo, der normalerweise transparent, sollte jetzt stehen als eine weißliche Geist gegen die dunkelgrüne Farbe (Abbildung B). Viele Forscher verwenden Tusche (verdünnt auf 10% v / v) anstelle von Fast Green. In diesem Fall ist es wichtig, Tusche, die ungiftig ist, wie Pelikan Fount Tusche zu verwenden. </li></ol> 6. Machen Hinterhirn und Rückenmark Neuralrohr Läsionen <ol><li> Produce geschärft Wolfram Nadeln durch Flamm-Radierung in kurzen (2-3 cm) Stücke von 100 Mikrometer Durchmesser Wolframstab (Katalog-Nummer 719000, A &amp; R Systems, Seattle, Washington), mit einer Acetylen / Sauerstoff-Brenner. Dies wird durch Einstecken des Endes des Stabes sehr kurz in die Brennerflamme, bis ein Funke zu sehen ist, der die explosive Erosion der äußeren Schichten von Wolfram stellt, hinterlässt eine scharfe Spitze getan. </li><li> Mit einem geschärften Wolframnadel, Schnitt durch und lenken die Dotterhaut mit der Fläche für die Mikrochirurgie. </li><li> Mit einem zweiten geschärft Wolfram-Nadel (die Spitze der ersten Nadel wird oft nach dem Schneiden durch die Dotterhaut beschädigt und nicht für nachfolgende Mikrochirurgie fit), schneiden vorsichtig durch das Epithel über dem Neuralrohr und lenken es dann rund geschnitten und unter das Stück des Neuralrohrs entfernt werden, mit kurzen, schnellen Aufwärtsbewegungen (Abbildung C). Making the Querschnitten und dann die Längsschnitte ist in der Regel am erfolgreichsten. Schneiden Sie nicht zu tief oder Sie riskieren Eindringen zugrunde liegende Blutgefäße, die in der Regel tödlich. </li><li> Vorsichtig drehen oder ziehen Sie die Resektates Stück weg von der Läsion mit dem Wolfram-Nadel. Erweist sich dies als schwierig, es kann auch durch den Mund mit einem Saug-Glasmikropipette an flexiblen Schlauch entfernt werden. </li></ol> 7. Die Injektion von menschlichen Stammzellen a. Injektion in eine Läsion des Neuralrohrs Zeichnen Sie eine kleine Menge an Zellen in der Spitze eines Glasmikropipette durch den Mund Absaugen mit einem Kunststoffrohr. Die Arbeitsgruppe Konzentration der Zellsuspension muss für den Zelltyp, die injiziert werden optimiert werden. Montieren Sie die Mikropipette auf einem Mikromanipulator und verbinden Sie es zu einem Mikroinjektor Pumpe (zum Beispiel: PV830 Pneumatische PicoPump, WPI, Washington, USA). Unter visueller Kontrolle mit einem Dissektionsmikroskop, Führer der Mikropipette Spitze in der Läsion und sorgfältig vertreiben die Zellen durch Erhöhung des Luftdrucks (entweder durch Impulse konstanter Druck oder durch eine schrittweise Hochfahren der Druck) (Abbildung C). Wenn die gewünschte Menge an Zellen innerhalb der Läsion abgeschieden wird, ziehen Sie vorsichtig die Mikropipette. b. Injection in das Lumen des Neuralrohrs In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Zellen in das sich entwickelnde Gehirn Ventrikel injiziert, zum Beispiel, wenn die Zellen invasive genug, um den Zugriff auf das Nervengewebe in Abwesenheit von Läsionen zu gewinnen sind. Die Injektion von Zellen in das Lumen eines brain Region erfordert mit einem Entwicklungsstadium, bei dem das Lumen bietet eine ausreichend große Behälter und ist leicht zugänglich; HH Stufen 12 bis 18 sind in dieser Hinsicht günstig. Eine Läsion ist nicht erforderlich. Einfach durchbohren die Wand des Neuralrohrs mit dem Glasmikropipette vor der Injektion von Zellen. Die Schlüsselelemente für den Erfolg dieser Methode sind die Schärfe der Mikropipette und der Plötzlichkeit des Durchbruchs, eine zu langsame Bewegung und der Mikropipette Spitze kann nur Grübchen das Neuralrohr Wand ohne einzudringen. c. Systemische Injektion Systemische Injektionen können über die extra-embryonalen Blutgefäßen (ab HH Stufe 15, wenn diese Schiffe gut entwickelt sind) vorgenommen werden. Dies ist nicht selten von einigen Blutungen begleitet und da es viele kleine Arterien und weniger größeren Adern sind, sind intra-arterielle Injektion in der Regel sicherer, wenn es um den Embryo das Überleben geht. Auf der anderen Seite bieten intravenöse Injektionen schnelleren Zugriff der Zellen des Herzens und damit vermutlich eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen. Eine erfolgreiche Injektion erfordert einen scharfen Mikropipette mit einem Durchmesser kleiner als das Schiff gezielt. Nähern Sie sich dem Schiff entlang ihrer Achse in einem kleinen Winkel aus der Horizontalen (ca. 30 Grad). Drücken Sie die Mikropipette gegen das Schiff, bis das Schiff beginnt zu verschließen. Dann weiter voranzutreiben in einen festen, abrupte Bewegung zu durchdringen. Einfahren langsam, bis das Blut gesehen, durch die Kapillarwirkung in die Spitze der Mikropipette zu ziehen. Die Injektion von Zellen sollten dann unter Verwendung konstanter Druck, nach denen die Mikropipette mit einer schnellen Bewegung zurückgezogen wird. 8. Sealing das Ei <ol><li> Nach der Injektion, lassen das Ei stehen noch für ein paar Minuten, damit sich die injizierten Zellen, sich niederzulassen und zu halten. Zur Vermeidung von Dehydrierung (die können schnell auftreten und tödlich), lag ein Stück angefeuchteten Tuch oder Filterpapier über dem Fenster während dieser Ruhezeit. </li><li> Nach ein paar Minuten, und die Zellen angesiedelt haben, trocknen Sie die Schale um das Fenster und Abdichtung der Fenster mit herkömmlichen Kunststoff-Band. Achten Sie darauf, dieses Siegel ist eng und dass kein Albumin durch die Öffnung oder zwischen der Schale und dem Band (dies erweist sich oft als während der anschließenden Inkubation tödlich) auslaufen. </li><li> Ersetzen Sie die Eier auf die Zwangs-Entwurf Inkubator für die weitere Entwicklung. Die Beobachtung kann in Abständen durch das Entfernen des Bandes über die Fenster erfolgen. </li></ol> 9. Embryo Dissektion <ol><li> Sobald der Embryo die gewünschte Stufe erreicht, knacken das Ei in eine Schüssel mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (das Band für den Fenster sollten zuerst geschnitten werden, um die beiden Hälften der Eierschale zu trennen lassen). Das eiskalte Kochsalzlösung dient dazu, den Embryo durch Unterkühlung zu betäuben. Das Herz sollte schnell verlangsamen und zu stoppen innerhalb von ein paar Minuten. </li><li> Separate der Embryo aus der extraembryonalen Membranen und Stadium mit ref. 11. </li><li> Enthaupten des Embryos, die Übertragung auf einen Dissektion Gericht, dass eine Silikon-Kautschuk Boden hat und enthält Sauerstoff physiologischer Kochsalzlösung mit Glucose (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na-Phosphat, 5 ergänzt mM HEPES, 11 mM Glucose, pH 7,4) und stecken Sie es schnell Bauchseite auf. Entfernen Sie die Bauch-und Brustorgane. Mit einer abgewinkelten Schere, machen Längsschnitten entlang jeder ventrolateralen Aspekt der Wirbelsäule. Besonders in späteren Phasen (nach Tag 6 der Entwicklung), ist der erste Schnitt am besten in der lumbosakralen Region, wo der Raum zwischen den Wirbeln und das Rückenmark am größten ist gemacht. Entfernen Sie die ventral der Wirbelsäule mit dem Rückenmark zu offenbaren. Stellen Sie sicher, dass die physiologische Kochsalzlösung Sauerstoff durch Einblasen von etwa 10-minütigen Intervallen mit reinem medizinischen Sauerstoff bleibt. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig die entstehende dorsalen und ventralen Wurzeln auf beiden Seiten, Transekt das Rückenmark an das gewünschte Niveau, und heben Sie sie vorsichtig aus dem Wirbelkanal. Das Rückenmark wird für viele Stunden in diesem Zustand überleben und können anatomische 12 und physiologischen 13,14 Experimenten unterzogen werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. A) Der geeignetste Ansatz für die Evakuierung von Albumin. Beachten Sie die Position des Embryos und die Platzierung der Nadel. B) Gegenüberstellung des Embryos. Beachten Sie das Eindringen der Nadel außerhalb der Keimscheibe. C) Schematische Darstellung des Verfahrens zur einseitigen Rückenmark Neuralrohr Läsion durch Stammzelltransplantation gefolgt.

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Der Hühnerembryo ist eine praktische und vielseitige Tiermodell für die Xenotransplantation Experimente. Das Fehlen eines funktionierenden Immunsystems während der embryonalen und fetalen Entwicklung ermöglicht das Überleben und die Entwicklung von Zellen aus jeder Art, die Inkubationstemperatur toleriert. Hühnerembryonen wurden verwendet, um das regenerative Potenzial von verschiedenen Arten von Stammzellen (in Lit.. 15) zu testen. Mammalian Stammzellen können in Hühnerembryo Geweben, einschließlich des zentralen Nervensystems, wo sie entstehen Neuronen, deren Axone Prognosen geben kann integrieren, kann synaptischen Konnektivität und elektrophysiologischen Eigenschaften in Zusammenhang mit der funktionellen neuronalen Schaltkreisen 1,2 beurteilt werden. Da die chirurgische Verfahren relativ einfach sind, und Injektionen sind unter visueller gemacht anstatt stereotaktischen Kontrolle, kann die Anzahl der Embryonen leicht erhöhte sich auf verschiedenen experimentellen Bedingungen in einem einzigen Experiment unterzubringen. Typischerweise Zellen lassen sich in 20-30 Embryonen innerhalb eines 4-Stunden-Experiment injiziert werden. Die Nacheinspritzung Sterblichkeit der Embryonen ist der wichtigste limitierende Faktor. Es müssen Vorkehrungen getroffen, um die Blutung und Austrocknung zu vermeiden. Seien Sie sich bewusst, dass es bestimmte kritische Entwicklungsstadien, bei dem die natürliche Sterblichkeitsrate erhöht. Ergänzend zu den Embryo mit ein paar ml warmes, sterilisiert Huhn ringer nach der Injektion und am Tag vor kritischen Entwicklungsphasen, sowie die Gewährleistung, dass das Fenster in das Ei gut verschlossen und ausgerichtet ist, um ein Auslaufen zu vermeiden, verbessert das Überleben. Wenn das Leck durch das Band Dichtung auftreten, entfernen Sie das Klebeband, trockenen Oberflächen und re-Band. Einige Forscher verwenden Wachs und Glas oder Kunststoff Deckgläser, um das Fenster zu versiegeln. Die Sterblichkeit ist nicht wesentlich anders injiziert gegenüber scheinoperierten Embryonen. Obwohl wir hier auf der Injektion von menschlichen Stammzellen in die Anlage des Gehirns und des Rückenmarks konzentriert haben, können Stammzellen auch in der Anlage des anderen Organen (siehe zum Beispiel ref. 4) injiziert werden. Jedes Organ stellt seine eigenen Herausforderungen. Zum Beispiel kann die Injektion in das Herz wegen der hohen mechanischen Widerstand gegen das Eindringen Pipette und wegen der Bewegungen, die auf der anderen Seite durch Abkühlen der Embryonen auf Raumtemperatur vor der Injektion verlangsamt werden kann eine Herausforderung sein. Organe, die ein Lumen Mangel kann nicht unterbringen die Injektion von ausreichenden Mengen und können daher eine chirurgische Läsion zu einer Aufnahme zu erstellen. In unserer Erfahrung ist post-Läsion Geweberegeneration ein Vorteil, weil sie die Integration der menschlichen Stammzellen fördert in das Gewebe. Es können auch Zellen in embryonale Mesenchym wie die Dispergierung somitic Mesenchym oder die Migration Neuralleiste als eine Möglichkeit zur Einbindung in mesenchymale Derivate, einschließlich Neuralleiste stammenden peripheren Ganglien 16,17 erreichen injiziert werden.

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xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo

Der Hühnerembryo ist ein klassisches Tiermodell für die Untersuchung normalen embryonalen und fetalen Entwicklung und für die Xenotransplantation Experimente, um das Verhalten von Zellen in einer standardisierten Untersuchung<em&gt; In vivo</em&gt; Umwelt. Die wichtigsten Vorteile des Hühnerembryo sind niedrige Kosten, hohe Verfügbarkeit, einfache chirurgische Manipulation und das Fehlen einer voll entwickelten Immunsystem. Xenotransplantation in Hühnerembryonen können wertvolle Informationen über Zell-Proliferation, Differenzierung und das Verhalten, die Reaktionen der Zellen auf Signale in definierten embryonalen Gewebe Nischen und tumorigenes Potential. Transplantation von Zellen in Hühner-Embryonen können auch einen Schritt in Richtung Transplantation Experimenten in anderen Tiermodellen werden. Vor kurzem hat die Hühnerembryo wurde verwendet, um die neurogene Potential des menschlichen Stamm-und Vorläuferzellen nach der Implantation in Neuralanlage bewerten<sup&gt; 1-6</sup&gt;. In diesem Video dokumentieren wir das gesamte Verfahren für die Transplantation menschlicher Stammzellen in den Entwicklungsländern zentrale Nervensystem des Hühnerembryo. Das Verfahren beginnt mit der Inkubation von befruchteten Eiern bis Embryonen der gewünschten Zeit entwickelt haben. Die Eierschale wird dann geöffnet, und der Embryo durch die Injektion von Farbstoff zwischen dem Embryo und dem Eigelb kontrastiert. Kleine Veränderungen sind in das Neuralrohr mit Mikrochirurgie gemacht, wodurch eine regenerative Website für Zellablagerungsvorrichtung dass spätere Integration fördert in das Wirtsgewebe. Wir zeigen, Injektionen von menschlichen Stammzellen in eine solche Läsionen in dem Teil des Neuralrohrs, dass die Hinterhirn und Rückenmark bildet, und in das Lumen des Teils des Neuralrohrs, dass das Gehirn Formen. Systemische Injektionen in extraembryonalen Venen und Arterien sind auch als eine alternative Möglichkeit, um Zellen zu vaskularisierten Geweben, einschließlich des zentralen Nervensystems liefern demonstriert. Schließlich zeigen wir, wie der Embryo aus dem Ei zu entfernen, nachdem mehrere Tage die weitere Entwicklung und wie man das Rückenmark frei für nachfolgende physiologische, histologische oder biochemische Analysen zu sezieren.

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Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

In diesem Papier stellen wir eine Methode für die Transplantation menschlicher Stammzellen in verschiedene Regionen des zentralen Nervensystems des Hühnerembryo. Dies bietet eine<em&gt; In vivo</em&gt; Modell zur Beurteilung der Proliferation und Differenzierung der verschiedenen Arten von menschlichen Stammzellen in embryonale Gewebe-Umgebungen.

Xenotransplantation von menschlichen Stammzellen in die Hühnerembryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.2K Aufrufe.  University of Oslo. In diesem Papier stellen wir eine Methode für die Transplantation menschlicher Stammzellen in verschiedene Regionen des zentralen Nervensystems des Hühnerembryo. Dies bietet eine In vivo Modell zur Beurteilung der Proliferation und Differenzierung der verschiedenen Arten von menschlichen Stammzellen in embryonale Gewebe-Umgebungen.

Serie: Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Counting Nervenstammzellen

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...