Hallo, ich bin Kai Jin von der Yangzhou University. Im Auftrag unserer Forschungsgruppe werde ich ein mächtiges Werkzeug des Hühnerembryos in der Entwicklungsforschung vorstellen. Hühnerembryo ist ein klassisches Entwicklungsmodell, das verwendet wurde, um Entwicklung und Differenzierung zu untersuchen, in der Tat sind die Fremdmessungen des Labors in Hühnerembryonen ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklungsbiologie, wie Gentransfektion, transgene Züchtung und die gonadale transmurale Vorbereitung.
In unserem Labor haben wir die Mu-Typ-Injektionsmethoden etabliert, aber für viele Forscher ist das Detail der Injektion unklar und schwer zu bestimmen. In diesem Video werden wir die Details der vaskulären Injektion in einem frühen Stadium der Entwicklung des Hühnerembryos in ovo zeigen. Zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren, wenn Sie daran interessiert sind.
Hier zeigen wir die Details des Protokolls. Entnahme und Zubereitung befruchteter Eier. Erstens, im Gegensatz zu Säugetieren hat das Huhn Millionen von Follikeln in einem einzigen Eierstock, aber nur wenige dieser Follikel sind reif genug, um zu ovulieren.
Jeder Follikel enthält eine Eizelle oder Keimzelle. Sobald der Follikel reift und sein Eigelb freigibt, wird er in den Trichter des Eileiters eingebaut. Wenn der Follikel in den Jugularabdomen des Eileiters eintritt, bindet sich der Samen an das Ei im Körper der Henne und das Kalzium im Körper der Henne bildet eine Schale, die das befruchtete Ei umhüllt und ein weiches Schalenei im Körper bildet.
Die Kalziumschalen verdicken sich allmählich, bis das Ei produziert ist. Sammeln Sie das befruchtete Ei, akademisch Embryoneier genannt, und legen Sie es ordentlich auf ein Gestell in einem Inkubator bei 37,8 Grad Celsius und 60% Luftfeuchtigkeit. Die Embryonen werden unter geeigneten Bedingungen inkubiert.
Nach zweitägigen Inkubationen erscheinen kleine pulsierende rote Punkte, die als Urherzen bezeichnet werden. Dieser Vorgang wird als Kirschschlag bezeichnet. Nach etwa 2,5 Tagen sind die Blutgefäße sichtbar und die Herz- und Körpersegmente haben sich gebildet.
Nadel- und Plasmidpräparation. Wir verwenden Glaskapillaren als Nadeln. Vor der Injektion bereiten Sie Glaskapillaren mit dem Außendurchmesser von einem Millimeter und dem Innendurchmesser von 0,6 Millimetern vor.
Die exogenen Materialien sind in der Regel Plasmide, verpackte Lentiviren und primordiale Keimzellen oder PGCs. In diesem Video verwenden wir das Trypanblau, um die Spuren von eingespritzten Materialien zu zeigen. Windowing. Bevor wir die Embryonen freilegen, müssen wir die Embryonen sterilisieren, um eine Keimkontamination zu verhindern.
Dies geschieht, indem die Oberfläche der Embryonen vorsichtig mit einem 75% Alkohol-Wattebausch an der Stelle der Eiöffnung abgewischt wird. Klopfen Sie nach der Desinfektion vorsichtig mit einer Pinzette auf das stumpfe Ende der Eierschale und befestigen Sie vorsichtig ein 0,5 Zentimeter mal 0,5 Zentimeter großes Loch auf der Oberfläche der Eierschale mit der Pinzette, um den Embryo freizulegen. In-ovo intravaskuläre Injektion.
Schauen Sie sich die Ansicht unter dem Mikroskop an, stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, um zuerst den Embryo zu lokalisieren, und finden Sie dann die Blutgefäße des Hühnerembryos zur Injektion bereit. Zielen Sie die Nadel mit der exogenen Substanz auf das Blutgefäß und beachten Sie, dass die Nadel parallel zu dem zu injizierenden Blutgefäß verläuft. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das Blutgefäß ein und schalten Sie dann die Luftpumpe ein.
An diesem Punkt gelangt die Fremdsubstanz in die Arterie und zirkuliert mit dem Schlagen des Herzens zurück zum Embryo durch die Arterie und dann zur Vene. Es gibt zwei Arten von vaskulären Injektionen. Die eine ist eine Kopfinjektion, bei der die Fremdsubstanz aus einer Vene im Kopf des Embryos injiziert wird und zurück in das Herz fließt.
Die andere ist eine dorsale Aorteninjektion, bei der die Fremdsubstanz mit dem Schlagen des Herzens zum Embryo zirkuliert. Mit dem Schlagen des embryonalen Herzens und der Zirkulation von Blut können wir deutlich sehen, dass das Fremdmaterial von den Kapillaren am Ende der Arterie, in die Vene aufgenommen wird und dann aus der Vene zum Embryo zurückkehrt, was darauf hindeutet, dass das injizierte Fremdmaterial effektiv an jeden Teil des Embryos abgegeben wird. Entfernen Sie nach der Injektion das Ei aus dem Stereomikroskop, schneiden Sie ein drei Zentimeter langes Stück medizinisches Klebeband mit einer kleinen Schere ab und befestigen Sie das Band an der Öffnung.
Kratzen Sie das Band vorsichtig mit der Schere, um Luftblasen herauszuquetschen, und schneiden Sie dann ein weiteres Stück Klebeband, um die Öffnung zu einem Kreuz zu versiegeln. Nach dem Verschließen der Öffnung werden die injizierten Embryonen vorsichtig wieder in den Inkubator gelegt. Hier zeigen wir die repräsentativen Bilder von Hühnerembryonen nach der Injektion.
Das erste Bild zeigt das Ergebnis der Lentivirus-Plasmid-Injektion. Die grüne Fluoreszenz unter einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop zeigt die erfolgreiche Expression von injiziertem Plasmid in Embryonen an. Dies deutet auf die Machbarkeit der intravaskulären Injektion von Plasmiden in Hühnerembryonen hin.
Das zweite Bild zeigt die Ergebnisse der PGC-Injektion. Die PGCs wurden mit RFP gekennzeichnet. Auf diesem Bild konnten wir die injizierten PGCs sehen, die hier die roten Punkte sind, die sich in der Gonade des Empfängers befinden.
Dies deutet darauf hin, dass die Geber-PGCs in der Lage waren, effektiv in die Gonade der Empfänger einzudringen und zu kolonisieren. Zusammenfassend stellt dieses Protokoll den Prozess der intravaskulären In-Ovo-Injektion von exogenen Materialien, Plasmiden oder PGCs in Hühnerembryonen dar. Die hier gezeigte Methode ist leicht zu befolgen und zu erlernen und lohnt sich die Anwendung in vielen Bereichen.
Das ist alles, was ich mit Ihnen teilen möchte. Ich hoffe, dass dieser Ansatz Ihre Arbeit als leistungsfähiges Forschungsinstrument beim Setzen von Hühnerembryonen und der Entwicklungsbiologie erleichtern wird. Vielen Dank, dass Sie sich dieses Video angesehen haben und viel Erfolg bei Ihrer Recherche.
