Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, bioaktive Signalmoleküle zu isolieren, die von Reptilien in der chemischen Kommunikation verwendet werden. Neben der Trennung und Reinigung dieser Verbindungen für zusätzliche Tests oder sogar Identifikation. Mit dieser Methode können Forscher eine Quelle von chemischen Signalen erhalten und sie dann für ihre Quantifizierung oder Bioassay-Nutzung isoliert extrahieren.
Die Demonstration des Verfahrens heute wird Holly Rucker, eine Ehrendoktorandin aus meinem Labor. Beginnen Sie damit, fünf Zentimeter quadratische Stücke in einen verschließbaren Glasbehälter mit einem hexan-kompatiblen Deckel zu legen und dem Behälter genügend Hexan hinzuzufügen, um die Schuppenhautstücke vollständig zu versenken, bevor sie den Behälter versiegeln. Verwenden Sie am nächsten Tag saubere Metallzangen, um die Schuppenstücke zu entfernen, die Stücke zu schütteln, während sie gefangen werden, um alle verbleibenden Hexane im Behälter zu behalten.
Um die extrahierte Lipidmasse zu bestimmen, übertragen Sie den Extrakt in einen vorgewogenen, runden Bodenkolben und schalten Sie die Vakuumquelle an den Rotationsverdampfer ein, um sicherzustellen, dass der Vakuumdruck ausreicht, um den Kolben bis zum Hals des Kondensators zu halten. Öffnen Sie den Entlüftungsventil am Ende des Kondensators, schieben Sie den Kolben auf den Hals des Kondensators und schließen Sie den Entlüftungsschacht, um das System zu versiegeln. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich der Kolben nicht vom Kondensator trennen kann, wenn der Kolben gelöst wird.
Senken Sie den Kolben, bis nur die unteren 10% des Kolbens das Wasser im Bad berührt, und starten Sie die Drehung mit mittlerer Geschwindigkeit. Wenn Vakuum, Geschwindigkeit, Kondensatorfluss und Badtemperatur optimal sind, kondensiert der Lösungsmitteldampf, der den Kolben verlässt, auf der Spule und tropft in den Rückgewinnungskolben. Verdampfen Sie die Probe unter dem Vakuum, bis eine Perle mit Flüssigkeit mit einem Durchmesser von weniger als einem Zentimeter im Boden des Kolbens sichtbar ist.
Schalten Sie dann die Drehung und das Vakuum aus und heben Sie den Kolben aus dem Bad. Halten Sie den Kolbenhals, wenn die Vakuumdichtung losgelassen wird, und drehen Sie den Hals, um den Kolben vom Kondensator zu seite. Die Perle der Flüssigkeit im Extrakt wird sich verfestigen, wenn das Hexan verdunstet.
Nachdem die Perle bei Raumtemperatur für etwa fünf Minuten getrocknet ist, bilden die Lipide ein transluzentes weißes bis gelbes Wachs im Kolben. Wiegen Sie den Kolben, um die endgültige Masse zu erhalten und die Lipide im aufgezeichneten Hexanvolumen zu löslich, um ein Milligramm oder mehr Lipid pro Milliliter Hexan zu ergeben. Um eine Chromatographiesäule vorzubereiten, verwenden Sie einen hölzernen Dübelstab, länger als die Säule, um ein vier mal vier Zentimeter großes Quadrat aus gefaltetem Fiberglas am Boden einer Glaschromatographiesäule zu positionieren.
Sichern Sie die Säule in einer Dunstabzugshaube an einem Standard-Ringständer und öffnen Sie den Stopphahn. Als nächstes waschen und getrockneten Sand in die Säule gießen, bis etwa drei Zentimeter Sand über dem Fiberglas ruht. Legen Sie dann dunkles Papier unter die Säule und tippen Sie vorsichtig darauf.
Legen Sie nun einen 500-Milliliter-Becher unter die Säule und befeuchten Sie den Sand langsam mit etwa 25 Milliliter Hexan, wobei der Hahn geschlossen wird, wenn sich etwa 0,5 Zentimeter Hexan über dem Sand befinden. Um die neutrale Beleuchtung zu aktivieren, deionisierte Pipetten wasser von einem Volumen von 6% der Beleuchtungsmasse in Tropfen in der gesamten Beleuchtung. Und bedecken Sie den Kolben der aktivierten Beleuchtung, kräftig wirbeln die Lösung, um gleichmäßig die Ladung zu zerstreuen.
Wenn keine sichtbaren Klumpen von Beleuchtung übrig bleiben, fügen Sie Hexan hinzu, bis das Leuchtgut vollständig mit etwa 0,5 Zentimeterhexan bedeckt ist. Wirbeln Sie den Kolben zu einer Gülle und legen Sie einen neuen 500 Milliliter Glasbecher unter die Säule. Öffnen Sie den Stopphahn, dann wirbeln Sie die Leuchte wieder, bevor Sie die Beleuchtung stetig in einen belüfteten Trichter gießen, der im Reservoir der Säule gehalten wird, wobei darauf geachtet wird, dass sich das Leuchte in der Säule gleichmäßig absetzt und sich keine großen Blasen oder Risse bilden.
Die Säule wird gebildet, wenn die Oberseite der Beleuchtung stabil ist und etwa vier Zentimeter unter dem Hals der Säule an der Basis des Reservoirs. Verwenden Sie dann eine Pipette, um das Innere des Reservoirs mit Hexan für Restbeleuchtung zu spülen, und fügen Sie vorsichtig eine zweite Sandschicht auf der Höhe auf etwa einen Zentimeter unter dem Reservoir hinzu. Für die Fraktionierung des Lipidextrakts verwenden Sie eine lange Glaspipette, um die Lipidprobe auf die Säule zu übertragen und langsam den Extrakt zu pipette, um eine Störung der Sandschicht zu vermeiden.
Spülen Sie den Extrakt mit fünf Milliliterhexan ab und übertragen Sie die Wäsche auf die Säule. Wenn der gesamte Extrakt hinzugefügt wurde, öffnen Sie den Stopphahn, und lassen Sie die Probe in die Spalte laden. Sobald die Probe zugegeben ist, muss die Säule mit Lösungsmittel gesättigt bleiben.
Wenn die Spalte austrocknet, geht die Probe verloren. Legen Sie einen vorgewogenen und beschrifteten runden Bodenkolben unter die Säule, um den ersten Bruch zu sammeln. Und verwenden Sie einen belüfteten Glastrichter, um 100% Hexan an die Seite des Reservoirs zu gießen, um eine Störung der Sandschicht zu vermeiden.
Öffnen Sie dann den Stopphahn, um die Elution zu beginnen, und schließen Sie den Hahn, wenn etwa drei Milliliter Hexan über dem Sand oben in der Säule verbleiben. Da größere Tiere aufgrund ihrer größeren Gesamthautoberfläche natürlich mehr Hautlipide produzieren, ist es wichtig, die extrahierte Lipidmasse auf die Schnauchöffnungslänge des Tieres zu veranlassen. Einmal auf die gesamte Schuppenhautmasse standardisiert, wird die lineare Beziehung der extrahierten Hautlipidmasse mit der Masse der extrahierten Schuppenhaut vollständig entfernt.
Nach der Fraktionierung kann derselbe Standardisierungsansatz mit den Massen der einzelnen Fraktionen verwendet werden. Zum Beispiel trägt hier jede Fraktion nicht gleichmäßig zur gesamten extrahierten Lipidmasse bei, da die neutralen Lipide die dominante Menge von Verbindungen nach Masse sind, verglichen mit jedem Satz von mehr polaren Lipiden. Wenn die Identifizierung von Verbindungen das ultimative Ziel ist, verwenden Sie sauberes Glasund und Sie müssen Kunststoffe vermeiden, um eine Kontamination der Proben zu verhindern.
Zur Identifizierung von Verbindungen kann die Flüssig- oder Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie nach der Probenentnahme verfolgt werden. Alternativ können Bioassays durchgeführt werden, um die Bioaktivität der Probe aufzuklären.
