Dieses Protokoll bietet eine praktikable Möglichkeit, die richtigen extrazellulären Vesikel aus den meisten Blut- und Feststoffgeweben zu isolieren und zu sammeln, insbesondere ihre Quelle und den Proteingehalt zu analysieren, was weitere funktionelle Experimente unterstützt. Neben der hohen Ausbeute und der geringen Kontamination ist der Hauptvorteil dieses Protokolls die Analyse von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die für physiologische und pathologische Studien nützlich ist. Es erleichtert die Diagnose von Krebserkrankungen wie entzündlichen Erkrankungen und Osteoporose durch die Detektion von Oberflächenmarkern von Elternzellen extrazellulärer Vesikel mit einem Durchflusszytometer.
Die Menge der extrazellulären Gewebevesikel ist entscheidend für die folgenden Experimente. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der extrazellulären Vesikel nicht hoch ist. Seien Sie geduldig, um die Verdünnung durchzuführen.
Bereiten Sie zunächst die Oberkieferknochenproben vor, indem Sie den Oberkieferknochen mit einer Augenpinzette und einer Schere isolieren und mit PBS waschen, um das Weichgewebe mit einer Pinzette zu entfernen. Dann legen Sie den Oberkieferknochen in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schneiden den Knochen mit einer Schere in kleine Stücke von einem Millimeter Durchmesser. Fügen Sie eine bestimmte Menge Liberase hinzu, um das Gewebe zu bedecken, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 800 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in ein neues und sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nachdem die vorbereiteten Plasma- und Knochenproben 15 Minuten lang bei 2.500 G und vier Grad Celsius zentrifugiert wurden, um großzellige Trümmer und verbleibende Blutplättchen zu entfernen, werden die Überstände vorsichtig in neue und saubere 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 16.800 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Als nächstes wird der Überstand entsorgt und die Pellets in jedem Röhrchen mit einem Milliliter PBS resuspendiert.
Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands, wie zuvor gezeigt, resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen mit 50 Mikrolitern PBS und lagern Sie diese Proben bei vier Grad Celsius für weniger als 24 Stunden oder verwenden Sie sie vorzugsweise sofort für die Analysen. Resuspendieren Sie die Proben mit 500 Mikrolitern PBS und übertragen Sie 50 Mikroliter in ein neues und sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen als Leerkontrolle, das als Röhrchen A gekennzeichnet ist, und weitere 50 Mikroliter in ein weiteres sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen als einfaches Färberöhrchen für FITC, das als Röhrchen B gekennzeichnet ist.Geben Sie 0,5 Mikroliter Membranfarbstoff in das Primärröhrchen für die Membranfärbung, während Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem das Primärröhrchen 30 Minuten lang bei 16.800 G zentrifugiert und der Überstand verworfen wurde, werden die Pellets mit 200 Mikrolitern PBS resuspendiert.
Jede 50-Mikroliter-Probe wird in vier 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, um einfache Färberöhrchen für PE zu erhalten, die als Röhrchen C markiert sind, Oberflächenmarker zu färben, die als Röhrchen D markiert sind, und sekundäre Antikörperkontrollen, die als Röhrchen E gekennzeichnet sind.Geben Sie den primären Antikörper von Osteoklasten-assoziierten Rezeptor- und Knochenextrazellulären Vesikelproben sowie CD-18-Antikörper- und Plasma-extrazelluläre Vesikelproben separat in Röhrchen B und Röhrchen D. eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand wie zuvor gezeigt und resuspendieren Sie die Pellets mit 500 Mikrolitern PBS. Zentrifugieren Sie erneut 30 Minuten lang bei 16.800 G und vier Grad Celsius, um die zusätzlichen primären Antikörper zu entfernen.
Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie die Pellets mit 50 Mikrolitern PBS, gefolgt von der Zugabe von FITC-konjugierten Sekundärantikörpern in Röhrchen E.Inkubieren Sie alle Röhrchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Verdünnen Sie einen Tropfen 0,2-, 0,5- bzw. eine mikrometergroße Perlensuspension in einen Milliliter PBS. Führen Sie dann jede Größe von Beads durch, um sicherzustellen, dass das für extrazelluläre Vesikel gewählte Gate ausgewählt wurde, und legen Sie den Schwellenwert des Durchflusszytometers fest, um mit einer geeigneten Vorwärts-Innenstreuung nach den Beads und der extrazellulären Vesikelpopulation zu suchen.
Legen Sie als Endbedingung die Berechnung von 100.000 membrangefärbten Partikeln fest und analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer, wie im Manuskript beschrieben. Die Pellets werden in 50 Mikrolitern RIPA-Lysepuffer resuspendiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Um die Proteinkonzentrationen aller Proben in der 96-Well-Mikrotiterplatte mit dem BCA-Proteinassay zu quantifizieren, werden die zwei Milligramm pro Milliliter BSA mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung auf 0,5 Milligramm pro Milliliter verdünnt.
Bei 0,5 Milligramm pro Milliliter BSA und 0,9 % normaler Kochsalzlösung in drei duplizierte Vertiefungen mit bestimmten Volumina. Lassen Sie dann zwei Mikroliter der Proben fallen und geben Sie 18 Mikroliter normale Kochsalzlösung separat in drei duplizierte Vertiefungen. Nachdem Sie eine Arbeitslösung durch Mischen von BCA-Reagenz A mit Reagenz B hergestellt haben, geben Sie 200 Mikroliter der Arbeitslösung in jede Vertiefung und schütteln Sie sie 30 Sekunden lang vorsichtig.
Anschließend wird die 96-Well-Mikrotiterplatte für 20 bis 25 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert und die optische Dichte bei 596 Nanometern mit dem Spektralphotometer gemessen. Exportieren Sie als Nächstes die Daten, zeichnen Sie eine Standardkurve und berechnen Sie die Proteinkonzentration der Proben. Den Ergebnissen zufolge werden die Proben mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung und der fünffachen Konzentration des SDS-PAGE-Ladepuffers auf ein Mikrogramm pro Mikroliter verdünnt, die Röhrchen mit Folie dicht verschlossen und fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius erhitzt.
Laden Sie die Proben in der Proteinleiter in eine Gradientenkonzentration von vier bis 20 % des Trisgels von HEPy. Lassen Sie das Gel im laufenden Puffer bei 80 Volt laufen, bis die Proteine eine Linie bilden. Schalten Sie dann für eine Stunde auf 120 Volt um, bis sich der Ladefarbstoff am Boden des Gels befindet.
Übertragen Sie das Gel auf die in Methylalkohol vorinkubierte Polyvinylidenfluoridmembran für 20 Sekunden mit einem Nasstransfersystem, um es eine Stunde lang bei 200 Milliampere zu übertragen. Bereiten Sie 5%BSA-Blockierpuffer vor, indem Sie 2,5 Gramm BSA und 50 Milliliter TBST in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Blockieren Sie die Membranen in diesem Puffer zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Rühren.
Inkubieren Sie die Membranen mit spezifischen Primärantikörpern, die mit TBST verdünnt sind, über Nacht bei vier Grad Celsius in die richtige Konzentration. Waschen Sie die Membranen viermal im Waschpuffer und inkubieren Sie die Membranen mit geeigneten Sekundärantikörpern eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rühren. Nachdem Sie die Membranen viermal im Waschpuffer gewaschen haben, bilden Sie die Membranen mit dem Chemilumineszenz-Kit in einem Gel-Bildgebungssystem ab.
Die Transmissionselektronenmikroskopie und die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigten, dass die typischen morphologischen Merkmale extrazellulärer Vesikel rund und becherförmig mit einem Durchmesser von 500 bis 300 Nanometern sind. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt den prozentualen Anteil spezifischer Membranmarker, die auf extrazellulären Vesikeln exprimiert werden, was auf ihre Herkunft aus den Elternzellen hindeutet. Die Western-Blot-Analyse zeigt die Expression von PID bzw. PKM2 als repräsentativ für den Proteingehalt und die extrazellulären Plasmavesikel und die extrazellulären Knochenvesikel, was auf den metabolischen Status hinweist.
Eine negative Expression von Golgin-84 in extrazellulären Vesikeln wurde durch die Anwesenheit von Mitofilin, Alpha-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 und Beta-Aktin zusammen mit dem Vesikelmarker CD9 nachgewiesen, während die CD81-Expression gering oder gar nicht vorhanden ist und APO-A-1 in den extrazellulären Plasmavesikeln fehlt. Forscher, also unter Berücksichtigung von Schritt 2.2, die Präparation und der Aufschluss der Gewebeproben sollten ausreichend durchgeführt werden. Andernfalls ist die Anzahl der extrazellulären Vesikel, die aus dem Gewebe extrahiert werden, begrenzt.
Die mit Markern markierte fluoreszierende Färbung der extrazellulären Vesikel kann in den Mund injiziert werden, um die Phase zu behandeln, die mit der potenziellen Funktion verbunden ist.
