TO und TD wurden von den JSPS KAKENHI-Zuschussnummern 19H02970 bzw. 20H02999 unterstützt.

1. Pflege von Laborkolonien
<ol><li>Für die Erhaltung von Wildtyp- und Mutantenpopulationen verwenden Sie einen großen Kunststoffbehälter (460 mm x 360 mm x 170 mm) mit regelmäßiger künstlicher Fischnahrung, Wasser in Plastikbechern mit einem Lüftungsloch auf der Oberseite, ein gefaltetes Papier zum Verstecken der Insekten und geschichtete Baumwolle zum Eierlegen(Abbildung 2A). Halten Sie alle T. domestica Kulturen in 37 °C Inkubatoren und stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit (RH) in jedem Behälter auf 60%–80%. HINWEIS: Da T. domestica Wasserdampf aus der Atmosphäre11absorbiert, ist eine direkte Wasserversorgung nicht erforderlich. Der entsprechende RH wird durch das Vorhandensein von Wasserdampf aus Kunststoffbechern, die ein Lüftungsloch auf der Oberseite oder von lidlosen Bechern in jedem Behälter enthalten, aufrechterhalten. Es besteht keine Notwendigkeit, in einem ganzen Brutkasten zu befeuchten, der Kulturen enthält. Die ungefähre Dauer jeder Entwicklungsphase unter der in diesem Protokoll beschriebenen Bedingung ist in Abbildung 1dargestellt. Die Entwicklungsgeschwindigkeit könnte durch Änderung der Temperatur und/oder RH12eingestellt werden.</li>
	<li>Fügen Sie Regelmäßig Lebensmittel hinzu. Fügen Sie Wasser hinzu, bevor es austrocknet.</li>
	<li>Übertragen Sie die Populationen mindestens alle drei Monate in einen neuen sauberen Behälter, da Erwachsene aufhören, Eier in einer schmutzigen Umgebung und/oder einer dichten Bevölkerung zu legen (siehe Diskussion).</li>
</ol>2. Eiersammlung und Mikroinjektion
<ol><li>Entwerfen einer Führungs-RNA (gRNA)<ol>
<li>Entwerfen Sie eine gRNA-Sequenz für jedes benötigte Ziel und BLAST die gRNA-Sequenzen gegen die Genombaugruppe, um mögliche Off-Target-Erkennungsstellen zu überprüfen.</li>
		<li>Synthesisieren und reinigen Sie die gRNAs gemäß den Anweisungen des Herstellers8. HINWEIS: Im Falle eines Targetings des weißen AtP-bindenden Kassettentransporters wurde beispielsweise eine Zielsequenz von 20 bp entwickelt und zwei synthetisierte DNA-Oligonukleotide 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTGTGTGGGAC-3' und 5'-TTCTAGCTCTAAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' bestellt. Die DNA-Vorlage wurde durch Glühen dieser beiden Oligonukleotide, gefolgt von PCR-Amplifikation, hergestellt und die gRNA wird dann in vitro aus der Schablone mit einer T7-RNA-Polymerase transkribiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereiten von Eiersammelkolonien<ol>
<li>Überführen Sie etwa 20 männliche und 20 weibliche Erwachsene in einen mittelgroßen Behälter (200 mm x 150 mm x 90 mm) mit Nahrung, Wasserversorgung, gefaltetem Papier und einem kleinen Stück geschichteter Baumwolle für die Eiablage(Abbildung 2B).</li>
		<li>Richten Sie mehrere Kolonien ein, um eine große Anzahl von inszenierten Embryonen in kurzer Zeit zu erhalten, um für die Genombearbeitung verwendet zu werden. HINWEIS: Es wird erwartet, dass nach 8 h bei 37 °C etwa 20 bis 40 Eier aus einer Kolonie gesammelt werden. Es dauert in der Regel ein paar Tage für übertragene Erwachsene, um Eier zu legen, möglicherweise aufgrund der Anpassung an eine neue Umgebung.</li>
	</ol></li>
	<li>Ersetzen Sie am Tag der Injektion die Baumwolle in den Behältern durch neue.</li>
	<li>Legen Sie ein 76 mm x 5 mm doppelseitiges Klebeband auf einen normalen 76 mm x 26 mm Glasschlitten.</li>
	<li>Acht Stunden später sammeln Sie die Eier aus der geschichteten Baumwolle, indem Sie die Schichten mit Zangen trennen.</li>
	<li>Richten Sie die Eier auf dem doppelseitigen Klebeband mit einem nassen Pinsel aus und halten Sie einen Abstand von 2 mm zwischen den Eiern. Alle Eier sollten so ausgerichtet sein, dass die Längsachse eines Eis der Injektionsseite gegenübersteht (Abbildung 3A). Drücken Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel für festes Halten während der Injektion. HINWEIS: In diesem Protokoll wächst Pilz schnell in beschädigten injizierten Eiern unter nassem und warmem Zustand. Es ist wichtig, den Abstand zwischen den Eiern zu halten, um Kreuzkontamination und Ausdehnung des Pilzes zu verhindern.</li>
	<li>Mischen Sie das gRNA- und Cas9-Protein auf eine Endkonzentration von 100 ng/l bzw. 500 ng/l. Verwenden Sie destilliertes Wasser zur Verdünnung. Inkubieren Sie die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur, um Ribonukleoprotein-Komplexbildung zu fördern und dann die Mischung auf Eis zu halten. HINWEIS: Neutrales Rot in einer Endkonzentration von 1% könnte der Injektionslösung hinzugefügt werden, um die injizierte Menge zu überwachen.</li>
	<li>Mit einem Mikrolader 2 l der gRNA/Cas9-Lösung in eine Glasinjektionskapillare einzuladen. Stellen Sie sicher, dass sich vor der Injektion keine Luftblasen in der Lösung befinden. Tippen Sie bei Bedarf auf die Nadel, um die Blasen zu entfernen. HINWEIS: In diesem Experiment wird eine fertige Nadel verwendet, um eine feine Nadelspitze zu erhalten (Abbildung 3B). Stattdessen könnte eine selbstgemachte Nadel mit ähnlicher Form verwendet werden.</li>
	<li>Befestigen Sie die Glasinjektionskapillare, die zuvor mit der gRNA/Cas9-Lösung beladen war, an einem mit einem Manipulator ausgestatteten Halter fest und schließen Sie den Halter an einen elektronischen Mikroinjektor an.</li>
	<li>Optimieren Sie die Form der Nadelspitze, indem Sie sie leicht mit Zangen brechen, um Verstopfung zu verhindern und eine bessere Haltbarkeit während einer Reihe von Injektionen zu erhalten (ein Beispiel für eine geeignete Nadel ist in Abbildung 3Cdargestellt). HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Nadel zu wechseln, wenn sie verstopft ist. Es ist möglich, weiterhin mit der gleichen Nadel zu injizieren, wenn es wieder mit Zange gebrochen wird, aber eine breitere Spitze führt zu mehr Eischaden und senkt ihre Überlebensrate. Da T. domestica Eier weich und zerbrechlich sind, ist das Halten einer feinen Nadelspitze der Schlüssel für eine hohe Überlebensrate nach der Injektion.</li>
	<li>Setzen Sie die Nadel an der Mitte der Längsachse eines Eis ein und injizieren Sie eine leichte Menge der Lösung (siehe Abbildung 3D-H zur Angabe der Injektionsmenge). Passen Sie die Konfiguration des elektronischen Mikroinjektors während der Injektion an, abhängig von der Form der Nadelspitze. HINWEIS: Es wird empfohlen, während der Injektion einen konstanten Druck aufzutragen, da sonst klebrige Eiinhalte leicht in die Glasnadel fließen und sie verstopfen können. Die Lösung kann sein, entweder mit einem kurzen Druckimpuls oder mit einem konstanten Druck zu injizieren, abhängig von der Menge der injizierten Flüssigkeit. Denken Sie daran, dass, wenn eine Nadelspitze eine breite Öffnung hat, zu viel Lösung in ein Ei injiziert wird, was tödlich enden(Abbildung 3F-H). In diesem Fall einen konstanten Flüssigkeitsfluss durch konstanten Druck aufrecht erhalten, dann die Nadel in ein Ei einsetzen und sofort herausziehen. Wenn es zu viel Überlauf verursacht oder das Ei platzt, ändern Sie die Nadel.</li>
	<li>Bewahren Sie die injizierten Eier in einem Behälter mit der entsprechenden Größe für die Anzahl der injizierten Eier (<20 Eier: kleine Schale; >20 Eier: mittelgroße Behälter) mit 60%–80% RH und 37 °C auf.</li>
</ol>3. Paarung
<ol><li>Überprüfen Sie die injizierten Eier regelmäßig und entsorgen Sie beschädigte Eier mit Zangen, um Pilzwachstum zu vermeiden (Abbildung 3I,J). Falls zu viel Pilz auf einem Ei wächst, reinigen Sie die Oberfläche des Eis mit 70% EtOH.</li>
	<li>Vor dem Schlüpfen (ca. 10 Tage bei 37 °C nach Eiablage) die Glasrutsche mit den injizierten Eiern in Talkumpulver tauchen, um die Oberfläche des doppelseitigen Bandes zu beschichten. Dies wird das Stapeln von geschlüpften Nymphen vermeiden. Übertragen Sie die pulverbeschichteten Glasrutschen in einen mittelgroßen Behälter mit Nahrung, Wasser und einem gefalteten Papier zum Verstecken der Insekten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Glasgleitet, nachdem die Nymphen geschlüpft sind. Liefern Sie regelmäßig Nahrung, bis sie das Erwachsenenalter erreichen. HINWEIS: Es dauert etwa 2,0–2,5 Monate, bis Personen nach dem Schlüpfen das Erwachsenenalter erreichen (Abbildung 1A). Die Erwachsenenstufe wird anhand eines gut entwickelten Eileiters bei Frauen beurteilt (Abbildung 1B).</li>
	<li>Um die Individuen zu paaren, übertragen Sie so viele wie nötig wilde weibliche Erwachsene aus einer Laborkolonie in den mittelgroßen Behälter und bebrüten sie für mindestens 14 Tage bei 37 °C, um sicherzustellen, dass sie jungfräulich sind. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, jungfräuliche Weibchen aus einer Laborkolonie zu sammeln, weil erwachsene T. domestica einen wiederholten Zyklus von Molting und Paarung namens "Reproduktiv- und Molting-Zyklus", während der Weibchen werfen Weg Sperma mit jedem Molt und mate wieder in den nächsten Befruchtungszyklus13.</li>
	<li>Übertragen Sie entweder einen männlichen oder einen weiblichen G0-Erwachsenen, der sich aus einem injizierten Ei und Wildtyp-Erwachsenen entwickelt hat, auf eine kleine Plastikschale (ca. 100 mm x 40 mm) mit Nahrung, einem gefalteten Papier und einem kleinen Stück Baumwolle zum Legen von G1-Eiern(Abbildung 2C'; Paarungsschale). Bewahren Sie die Paarungsgerichte in einem größeren Behälter mit 60%–80% RH auf (Abbildung 2C). HINWEIS: Mehrere Wildtyp-Erwachsene können in ein Gericht aufgenommen werden, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Paarung zu erhöhen, obwohl hohe Erfolgsraten mit eins-zu-eins-Paarung erreicht wurden.</li>
</ol>4. Genotypisierung
<ol><li>Entwerfen Sie PCR-Primerpaare für jede gRNA, um ein 100–200 bp Produkt zu verstärken, das die von der gRNA angestrebte Site enthält. BLAST jede Primersequenz gegen die Genombaugruppe, um ihre Spezifität zu überprüfen (ein Beispiel für die Ausrichtung des weißen Gens in Abbildung 4A).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Keimbahntransformation von G0-Erwachsenen.<ol>
<li>Fünf Tage nach dem Legen der Eier einzelne G1-Eier von jedem G0-Erwachsenenpaar in 0,2 ml-Röhrchen (ein Ei pro Tube; gesammelte Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern). Trennen Sie die Baumwollschichten, um die Eier zu sammeln. HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens 12 G1-Nymphen aus jedem Paar zu genotypisieren, um den Erfolg der Keimbahnübertragung zu bewerten (siehe Repräsentative Ergebnisse).</li>
		<li>Fügen Sie jeder Tube 15 l einer 0,25 mg/ml Proteinase-K-Lösung (gelöst in Tris-EDTA-Puffer) hinzu, homogenisieren Sie Proben kurz mit Zahnstochern und inkubieren Sie bei 55 °C für 3 bis 16 h.</li>
		<li>Inaktivieren Sie die Proteinase K, indem Sie die Proben 10 min bei 95 °C platzieren.</li>
		<li>Fügen Sie 90 l destilliertes Wasser in jedes Rohr und mischen Sie gut. Verwenden Sie 2 l Überstand in einem 10-L-PCR-Reaktionsmix, der die in Schritt 4.1 entworfenen Primer enthält. HINWEIS: Die Verwendung einer DNA-Polymerase, die für rohe Schablonen optimiert ist, wird empfohlen, um eine ausreichende PCR-Verstärkung zu erreichen.</li>
		<li>Um die PCR-Produkte zu analysieren, führen Sie einen Heteroduplex Mobility Assay (HMA) mit einem Mikrochip-Elektrophorese-System durch (Abbildung 3B; siehe Ohde et al., 2018)8. ANMERKUNG: Mutationen könnten mit zwei alternativen Methoden bewertet werden: (1) HMA mit Standard-Gelpolymeren, wie z. B. 8% Polyacrylamid14; (2) Vergärung von PCR-Produkten mit T7-Endonuklease, gefolgt von Agarose-Gel-Elektrophorese15.</li>
		<li>Bewahren Sie nur die G1-Nymphen auf, die von G0-Erwachsenen stammen, die Mutationen in ihrer Keimbahn enthalten, und entsorgen Sie die anderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Individuelle Genotypisierung von G1-Nymphen/Erwachsenen<ol>
<li>Isolieren Sie G1-Nymphen in 24-Well-Platten mit einem Aspirator oder einem Pinsel. Legen Sie die 24-Well-Platten in einen größeren Behälter (z. B. den in diesem Protokoll verwendeten mittelgroßen Behälter) mit Wasserversorgung, wie oben beschrieben, um einen RH von 60 % bis 80 % zu halten(Abbildung 1D). Die Versorgung mit künstlichen regelmäßigen Fischfuttern aufrechtzuerhalten(Abbildung 1D'). HINWEIS: Obwohl dieser Schritt an jedem Punkt der Nymphen- und Erwachsenenstadien durchgeführt werden kann, wird empfohlen, ihn nach Erreichen des Erwachsenenalters und kurz vor der Paarung durchzuführen (>2,5 Monate nach der Injektion; Abbildung 1B) weil es einfacher ist, Feuerratten in einem großen Behälter zu warten. Die individuelle Aufzucht ist erforderlich, um den Genotyp jeder G1-Nymphe auf den folgenden Schritten zu verfolgen. G1 Nymphen aus dem gleichen G0-Erwachsenen können unterschiedliche Mutationen haben.</li>
		<li>Cerci und das kaudale Filament einer Nymphe/Erwachsenen mit Zangen kneifen und ziehen und in ein 0,2 ml-Rohr mit 50 L EtOH einsammeln (die gesammelten Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern). HINWEIS: Gewebeproben werden in EtOH gesammelt, da es den Verlust dieser kleinen Proben durch statische Elektrizität verhindert. Wenn man die Bewegung von Insekten stoppen muss, befeuchten Nymphe/Erwachsener auf Eis, wenn man Gewebeproben nimmt. Da T. domestica nach einer langzeitigen Abkühlung auf Eis nicht überleben kann, befeuchten Sie sie nicht länger als eine Minute und bringen Sie sie sofort wieder auf Raumtemperatur. Die Ablation von Cerci und dem kaudalen Filament führt nicht zu einer Erhöhung der Sterblichkeit.</li>
		<li>Probenrohre mit geöffneten Deckeln auf einem Thermoblock 15 min bei 70 °C aufstellen, um den EtOH zu verdampfen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2–4.2.5 für die Genotypisierung.</li>
		<li>Übermitteln Sie die PCR-Produkte, bei denen ein mutiertes Bandmuster beobachtet wird, an einen Standardmäßigen Sanger-Sequenzierungsdienst.</li>
		<li>Halten Sie die G1 Nymphen/Erwachsenen mit den gewünschten Mutationen und verwerfen Sie die anderen (siehe Abbildung 4C für ein repräsentatives Sequenzierungsergebnis).</li>
	</ol></li>
	<li>Überqueren Sie die Erwachsenen, die die gewünschten Mutationen in einer Paarungsschale enthalten, und erhalten Sie die nächsten Generationen, um einen homozygoten mutierten Stamm zu etablieren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Für die erfolgreiche Erzeugung der gewünschten T. domestica Mutante mit CRISPR/Cas9 ist es zunächst wichtig, eine ausreichende Anzahl von inszenierten Embryonen zur Injektion zu sammeln. Für eine konstante Sammlung einer ausreichenden Anzahl von T. domestica Eiern ist der Schlüssel, eine geeignete Größe des Behälters zu wählen, um eine geringere Bevölkerungsdichte zu haben, da es zum erfolgreichen Abschluss einer Reihe von komplexen Paarungsverhalten beitragen würde, die nach jedem Erwachsene...

Thermobia domestica gehört zu einem der basalsten Insektenorden, Zygentoma, das einen uralten ametabolen und flügellosen Lebenszyklus behält. Eine solche basale phylogenetische Position und Ahneneigenschaften setzen diese Art als ein attraktives Modell für die Untersuchung der Mechanismen, die dem Erfolg von Insekten auf der Erde zugrunde liegen, die über 70% der beschriebenen Tierarten abdecken1. T. domestica wird seit langem hauptsächlich zur Untersuchung der Urmerkmale der Insektenphysiologie verwendet, da sie als Labormodell geeignet ist, wie z. B. einen relativ kurzen Lebenszyklus (2,5–3,0 Monate vom Embryo bis zum reproduktiven Erwachsenen; Abbildung 1A) und eine einfache Zucht. In den letzten drei Jahrzehnten wurde seine Verwendung erweitert, um ahnende Eigenschaften verschiedener Merkmale wie Körperplan, neuronale Differenzierung und zirkadiane Rhythmen2,3,4zu untersuchen.
Die Anwendung fortschrittlicher genetischer Werkzeuge in T. domestica könnte solche Beiträge in einem weiten Forschungsgebiet weiter beschleunigen. Erfolgreiche RNA-Interferenz (RNAi)-vermittelter Gen-Knockdown bei Embryonen, Nymphen und Erwachsenen wurde in T. domestica4,5,6berichtet. Die Effizienz von systemischen RNAi ist immer noch stark artenabhängig – zum Beispiel ist sie in coleoptera im Allgemeinen hoch, während sie in der Lepidoptera-Ordnung7niedrig ist. Die Effizienz und Dauer des RNAi-Knockdowns in T. domestica muss noch bewertet werden. Zusätzlich zu RNAi haben wir bereits über einen erfolgreichen CRISPR/Cas9-vermittelten Genknockout in T. domestica8berichtet. Das CRISPR/Cas-System wurde häufig für die Genombearbeitung bei Insekten eingesetzt, insbesondere für gezielte Genknockouts. Seine Verwendung könnte für andere Anwendungen wie Genreporter-Assay, Zelllinienverfolgung und Manipulation der Transkriptionsaktivität erweitert werden, indem exogene Konstrukte nach der Einrichtung eines Protokolls zur Bereitstellung von Komponenten des CRISPR/Cas-Systems in Kerne9eingeschlagen werden. In Kombination mit der veröffentlichten Genombaugruppe10würde die breite Nutzung und Weiterentwicklung der CRISPR/Cas-basierten Genombearbeitung in T. domestica Studien erleichtern, die sich auf die evolutionären Mechanismen hinter dem herausragenden adaptiven Erfolg von Insekten konzentrieren. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Embryo-Mikroinjektion und für die Paarung von Adult T. domestica, um einen mutierten Stamm mit CRISPR/Cas9 zu erzeugen. Unter Berücksichtigung dieser neuartigen Methode diskutieren wir, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie nicht-traditioneller Modellarten für erfolgreiche Anwendungen dieser Techniken zu berücksichtigen.

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

Der Feuerbrat Thermobia domestica ist eine ametabolöse, flügellose Art, die sich für die Untersuchung der Entwicklungsmechanismen von Insekten eignet, die zu ihrer erfolgreichen evolutionären Strahlung auf der Erde geführt haben. Die Anwendung genetischer Werkzeuge wie der Genombearbeitung ist der Schlüssel zum Verständnis genetischer Veränderungen, die für evolutionäre Übergänge in einem Evo-Devo-Ansatz verantwortlich sind. In diesem Artikel beschreiben wir unser aktuelles Protokoll zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme von T. domestica. Wir berichten von einer Trockeninjektionsmethode als Alternative zur gemeldeten Nassinjektionsmethode, die es uns ermöglicht, stabil hohe Überlebensraten bei injizierten Embryonen zu erhalten. Wir berichten auch über eine optimierte Umgebungseinstellung, um Erwachsene zu paaren und nachfolgende Generationen mit hoher Effizienz zu erhalten. Unsere Methode unterstreicht, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie jeder Art für die erfolgreiche Anwendung von Genombearbeitungsmethoden auf nicht-traditionelle Modellorganismen zu berücksichtigen. Wir sagen voraus, dass diese Genom-Editing-Protokolle bei der Implementierung von T. domestica als Labormodell helfen und die Entwicklung und Anwendung nützlicher genetischer Werkzeuge in dieser Spezies weiter beschleunigen werden.

In unseren Händen können etwa 100 Eier gut mit einer einzigen Injektionskapillare injiziert werden, wenn sie die entsprechende Spitze hat (Abbildung 3C). Die Injektion des gRNA/Cas9-Ribonukleoprotein-Komplexes in Embryonen innerhalb der ersten 8 h nach Eiablage führt zu Indels an der gRNA-Zielstelle. Dies führt dazu, dass biallelic Mutationen in einigen Zellen der injizierten Generation (G0) und damit mutierte Mosaik-Phänotypen werden in der Regel in G0 erhalten. Wenn dieses Protokoll b...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K Aufrufe.  Kyoto University. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Serie: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Forschung

Genetik

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Entwicklungsbiologie

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Verhalten

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Biotechnik

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Biologie

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

Hyperaktives SchweinchenBac Transposase-vermittelte Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...