Wir präsentieren grundlegende, aber sehr gefragte Massen für Massenaufzucht, Beobachtungen und molekulare Studien mit ernsthaften Schädlings-Tortrix-Massen, um ihre Biologie zu studieren. Bisher hat die Struktur der Insekteneier eine weitere Analyse verhindert. Insbesondere ermöglichten wir die Untersuchung dünner, weicher und zerbrechlicher Eier, die mit mütterlichem Sekret bedeckt waren.
Es gibt einfache Techniken, von denen erwartet wird, dass sie für die weitere Erforschung von Tortrix, das Ausprobieren anderer Insekten und anderer Taxa anwendbar sind. Beginnen Sie, indem Sie eine Frau und zwei Männer in einen 120-Milliliter-Plastikbecher mit einem Stück Paraffinpapier legen, um eine Matra-Linie zu etablieren. Schneiden Sie etwa 60 Gramm künstliche Diäten mit einer Reibe für die Massenaufzucht.
Legen Sie die mit reifen Embryonen gefüllte Eimasse auf die in Scheiben geschnittene künstliche Diät in einen Plastikbehälter. Legen Sie Paraffinpapiere mit den geschnittenen Diäten auf die Eiermasse. Legen Sie 15 Männchen und 10 Weibchen in eine Plastikbox zur Paarung bei 25 Grad Celsius.
Sammeln Sie alle fünf bis sieben Tage Eier und wiederholen Sie die Massenaufzuchtschritte für jede Generation. Weichen Sie die Eimasse in 1000 Mikroliter 1,2% natriumhypochloritöser wässriger Lösung für 10 Minuten oder in 1000 Mikroliter fünf molare Kaliumhydroxid-wässrige Lösung für 30 Minuten ein, um die Eier zu trennen. Waschen Sie die getrennten Eier in 1000 Mikrolitern PBSt.
Eier in einer Volumengewichtsmischung von 500 Mikrolitern 100% Heptan und 500 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd PBSt-Lösung einweichen. Mit einem Wirbelmischer 10 Minuten lang mit 1500 Umdrehungen pro Minute mischen. Weichen Sie die Eier in eine Mischung aus 500 Mikrolitern 100% Heptan und 500 Mikrolitern 100% Methanol ein.
Mischen Sie für 10 Minuten mit 1500 Umdrehungen pro Minute. Waschen Sie die Eier zweimal mit 1000 Mikrolitern 100% Methanol und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius in 100% Methanol. Weichen Sie die Eier nacheinander in 99% 70% und 50% Ethanol und PBSt für jeweils fünf Minuten zur Hydrophilisierung ein.
Waschen Sie die Eier mit PBSt. Tauchen Sie die Eier fünf Minuten lang in ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI-Lösung und waschen Sie die Eier dann zweimal mit PBS. Weichen Sie die Eier in 20 Mikrolitern 1,25% Milch-, Essig- oder ZN-Lösung ein, um Heterochromatin zu visualisieren, bis die Kerne eine leuchtend rote Farbe aufweisen.
Übertragen Sie die gefärbten Eier mit einer Pipette auf einen Glasobjektträger und schließen Sie sie dann mit einem Anti-Fade-Reagenz und einem Deckglas ein. Extrahieren Sie Ferrate, Amonamagnetama und Adoxophyes honmai Larven aus den Eiermassen mit Pinzetten. Sezieren Sie die Larven auf dem Glasobjektträger.
Fixieren Sie das Gewebe mit einer Mischung aus ein bis drei 99,7% Asketensäure in 100% Methanol für fünf Minuten. Färben Sie diejenigen mit 1,25% Gewichtsgewicht Milch-, Asketen- oder ZNS-Lösung, bis die Kerne gefärbt sind. Bestimmen Sie das Geschlecht jeder Probe, indem Sie das Vorhandensein von Heterochromatin für Frauen oder Abwesenheit für Männer unter einem Mikroskop beobachten.
Um DNA und RNA aus geschlechtsspezifischen Ferratlarven zu extrahieren, poolen Sie 12 geschlechtsspezifische männliche oder weibliche Ferratenlarven und fügen Sie entweder Zelllysepuffer oder RNA-Extraktionsreagenzien in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu. Die Fixations-, Permeabilisierungs- und Färbeschritte ermöglichen die Visualisierung von Kernen mit DAPI-Lösung. Milch-, asketische oder CN-Färbungen mit den sezierten Ferrate-Larven zeigten, dass Weibchen Heterochromatin als Punkt aufweisen, aber Männern fehlt das Heterochromatin.
Die modifizierten Protokolle unter Verwendung einer Spinsäule verbesserten die Qualität der RNA, die 900 bis 1500 Nanogramm Produkt mit einem Verhältnis von 260 zu 200 von 1,9 zu 2,1 und einem Verhältnis von 260 zu 280 von 1,9 zu 2,3 produzierte. Das RNA-Konzentrationsverhältnis für das modifizierte Protokoll lag unter 1,2 und erfüllte damit die Qualitätsanforderungen für die Sequenzierung der nächsten Generation. Die Unversehrtheit der aus dem Geschlecht extrahierten Ferrate-Larven unter Verwendung des modifizierten Protokolls wurde mittels Mikrochip-Elektrophorese bestätigt.
Es wurde bestätigt, dass die vorbereiteten Bibliotheken hohe Q 30-Score-Reads lieferten. Unsere Botschaft trägt zu grundlegenden Insektenstudien und Schädlingswerkzeugen bei. Darüber hinaus haben unsere Protokolle das Potenzial, zur Beurteilung der wirksamen chemischen Pestizide oder interzellulären Mikroben während der Embryogenese verwendet zu werden.
