Dieses Protokoll misst die Paarungswettbewerbsfähigkeit männlicher Mücken, was eine Voraussetzung für programme zur Unterdrückung der männlichen Mückenpopulation ist. Dieses Eignungskriterium wird im Rahmen der Qualitätskontrolle und Dehnungsbewertung bewertet. Diese Methode reduziert die Versuchszeit um 90% und ermöglicht den direkten Vergleich der Paarungswettbewerbsfähigkeit zwischen zwei sterilen oder Wolbachia-infizierten Linien.
Diese Prozedur werden von Irene Li und Keng Wai Mak durchgeführt. Zu Beginn sexen die männlichen und weiblichen Moskitos im Puppenstadium, entsprechend ihren Größenunterschieden. Für jeden Satz Moskitos 100 männliche Puppen in einen vormarkierten Käfig für die Saccharosefütterung oder Rhodamin B Saccharosefütterung.
Legen Sie die weiblichen Puppen in kleine Chargen von 40 bis 50 pro Käfig. Überprüfen Sie bei der Entstehung der Imagos die Käfige auf das Vorhandensein männlicher Moskitos. Um die 0,2% Rhodamin B Saccharoselösung herzustellen, lösen Sie 200 Milligramm Rhodamin B Pulver pro 100 Milliliter 10% Saccharoselösung.
Gut mischen, um sicherzustellen, dass das gesamte Pulver gelöst ist. Bereiten Sie 20 Zuckerzufuhrflaschen mit einem Docht vor. Fügen Sie 10 Milliliter 10% Saccharose zu 10 Feederflaschen und 10 Milliliter 0,2% Rhodamine B Saccharoselösung für die anderen 10 Feederflaschen hinzu.
Stellen Sie fünf Futterflaschen in jeden vorbereiteten männlichen Käfig und lassen Sie die männlichen Moskitos drei Tage lang vor dem Paarungsexperiment füttern. Schalten Sie die Quecksilberbrennerlampe und das Stereomikroskop ein. Lassen Sie die Lichtquelle zur Quecksilberbrennerlampe für 10 Minuten stabilisieren.
Stellen Sie dann die Fluoreszenzfilter für rotes Fluoreszenzprotein ein. Saugen Sie eine kleine Anzahl von Moskitos gleichzeitig in die Glasröhre des oralen Absaugers ab. Beobachten Sie durch die Glasröhre den Körper der männlichen Moskitos unter dem fluoreszierenden Stereomikroskop.
Verwenden Sie nur männliche Moskitos, die mit Rhodamin B für das Experiment markiert sind. Transferset Ein männliches Moskito in 12 Pappbecher, die mit Netzen gesichert sind. Legen Sie 10 saccharose gefütterte männliche Moskitos pro Tasse in sechs Tassen und 10 Rhodamine B Saccharose gefütterte männliche Moskitos pro Tasse in die anderen sechs Tassen.
Wiederholen Sie diesen Schritt für männliche Moskitos mit Satz B. Stellen Sie 12 Käfige für den Paarungstest auf. In jedem der sechs Käfige befinden sich 10 männliche Mücken, die mit Rhodamin B markiert sind, 10 unmarkierte männliche Moskitos mit Satz B und 10 jungfräuliche weibliche Wildtypmücken.
In den anderen sechs Käfigen sind 10 unmarkierte männliche Mücken, 10 mit Rhodamin B markierte männliche Moskitos und 10 jungfräuliche weibliche Wildtypmücken enthalten. Beschriften Sie diese Käfige, um klar zwischen den beiden Paarungskombinationen zu unterscheiden. Stellen Sie die jeweiligen Becher der Männchen gemäß den Etiketten in die Paarungskäfige.
Entfernen Sie das Netz und klopfen Sie vorsichtig auf die Tasse, um die Männchen aus der Tasse zu drängeln. Entfernen Sie vorsichtig den Pappbecher und das Netz aus dem Käfig, um sicherzustellen, dass keine Moskitos aus dem Käfig entweichen. Lassen Sie die männlichen Moskitos mindestens eine Stunde lang im Paarungskäfig akklimatisieren.
Übertragen Sie mit einem oralen Aspirator jungfräuliche weibliche Wildtypmücken in 12 Pappbecher, wobei jede Tasse 10 Moskitos enthält. Nach der Akklimatisierungszeit für die männlichen Moskitos eine Tasse Weibchen in jeden Paarungskäfig geben und das Netz entfernen. Drängeln Sie vorsichtig die Tasse, um alle verbleibenden weiblichen Moskitos aus der Tasse zu ermutigen, und entfernen Sie dann vorsichtig den Pappbecher und das Netz aus dem Käfig, um sicherzustellen, dass keine Moskitos aus dem Käfig entkommen.
Lassen Sie die Paarung drei Stunden lang stattfinden und beenden Sie dann das Paarungsexperiment, indem Sie alle Moskitos mit einem mechanischen Absauger aus jedem Käfig entfernen. Betäuben Sie die Moskitos mindestens fünf Minuten lang kalt auf Eis. Wenn die Moskitos vollständig betäubt sind, nehmen Sie die weiblichen Moskitos vorsichtig auf und beherbergen Sie sie in einem separaten Pappbecher, der mit Netzen gesichert ist.
Beschriften Sie den Pappbecher, indem Sie das entsprechende Etikett aus dem Steckkäfig auf den Becher übertragen. Um weibliche Spermatheken zu erhalten, betäuben Sie die weiblichen Moskitos mindestens fünf Minuten lang kalt auf Eis, bevor Sie unter einem Stereomikroskop sezieren. Sezieren Sie die weibliche Mücke unter dem Stereomikroskop.
Untersuchen Sie die Spermathecae unter dem Mikroskop. Wenn das Weibchen nicht befruchtet wird, wären alle drei Spermathecae leer, und wenn sie befruchtet würden, wären zwei oder drei der Spermathecae mit beweglichen Spermien gefüllt. Bestimmen Sie bei befruchteten Personen, ob die Spermathecae Rhodamin B-markierte Samenflüssigkeit enthalten, indem Sie sie unter dem fluoreszierenden Stereomikroskop untersuchen, das mit einem RFP1-Filter ausgestattet ist.
Wenn die Spermatheken mit Samenflüssigkeit gefüllt sind, die nicht mit Rhodamin B markiert ist, wird keine Fluoreszenz beobachtet. Auf der anderen Seite, wenn die Spermatheca Rhodamin B markierte Samenflüssigkeit enthält, würde sie orange fluoreszieren. Ziel dieses Paarungs-Wettbewerbstests war es, festzustellen, ob es nach mehreren Generationen der Inzucht zu einem Verlust der männlichen Paarungstauglichkeit führen könnte.
Es wurden experimentelle Triplikate des Paarungswettbewerbsfähigkeitstests durchgeführt, und die Besamungsdaten werden hier gezeigt. Wildtyp-Weibchen wurden entweder von den Inzucht- oder Outcross-Männchen mit gegenseitiger Markierung befruchtet. Die Ergebnisse zeigen, dass der Anteil der von den Inzucht- oder Outcross-Männchen befruchteten Weibchen durch die Rhodamin-B-Markierung nicht beeinflusst wurde.
Ein signifikant höherer Prozentsatz der Weibchen, die sich mit den Outcross-Männchen paarten als mit den Inzuchtmännen in allen drei Replikanten, was darauf hindeutet, dass Inzucht zu einem Verlust der Paarungsfitness führen könnte. Es ist wichtig, zusätzliche Käfige von weiblichen Moskitos vorzubereiten. Verwenden Sie keine weiblichen Moskitos aus einem Käfig, der mit männlichen Moskitos kontaminiert wurde, da vorbefruchtete Weibchen alle Daten ungültig machen würden.
Anders als der laborbasierte Paarungswettbewerbsfähigkeitstest kann dieses Verfahren in Markierungsfreisetzungsexperimenten verwendet werden, um die Paarungsbiologie von Insekten, die Populationsdynamik und ihre Ausbreitung zu untersuchen.
