Techniken, die die Bakterienbelastung überwachen und ein Neutrophiler gleichzeitig reagieren, können Einblick in die Mechanismen der Staph aureus Persistenz und die Wirksamkeit von Behandlungsstrategien geben. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass mehrere Parameter längs in einem Live-Host während der gesamten Dauer der Infektion gemessen werden können. Es ist wichtig zu zeigen, wo die Wunde auf einem Maus-Dorsum zu platzieren, wie die Haut zu verbrauchen, und wie die Wunde mit Staph aureus zu impfen.
Beginnen Sie mit dem Auftauen der Biolumineszenz Staph aureus Stamm von Interesse aus negativen 80 Grad Celsius Lagerung auf Eis. Vor der Streifte die Kultur auf einem 5%Rinder-Blut-Agar-Platte. Für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Morgen drei bis vier einzelne Kolonien von der Staph aureus Platte in die tryptische Sojabrühe (TSB) übertragen. Ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol für eine nächtliche Schüttelinkubation bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen 120 Mikroliter Kulturprobe in sechs Milliliter TSB verdünnen.
Mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol, für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,5 erreicht, übertragen Sie drei Milliliter bakterielle Suspension in 10 Milliliter eiskalte DPBS. Nach sorgfältiger Dekantierung des Überstandes zusätzliche gekühlte DPBS in das Pellet geben und die resuspendierten Bakterien gründlich wirbeln.
Nach einer zweiten Zentrifugation das bakterielle Pellet in 1,5 Milliliter PBS auf Eis wieder aufhängen. Zur Überprüfung der Bakterienkonzentration 100 Mikroliter der bakteriellen Suspension um den Faktor 1 x 10 bis 4 und 1 x 10 bis 5 in frischem PBS seriell verdünnen. Und Platte 20 Mikroliter jeder Verdünnung auf einzelnen Agarplatten.
Zählen Sie nach einer nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius die Anzahl der koloniebildenden Einheiten nach Grobuntersuchung, um die Bakterienkonzentration vom Vortag zu berechnen. Für exzisielle Hautverwundung der Empfängertiere, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifung, bevor Sie einen einmal zwei Zoll Abschnitt auf der Rückseite der Maus rasieren. Wischen Sie vorsichtig ab, um streunende Haare zu entfernen.
Und desinfizieren Sie die exponierte Haut, mit sequentiellen 10%povidon Jod, und 70%Ethanol getränkte Gaze Anwendungen. Sich von der Mitte des Operationsbereichs nach außen bewegen, in einem Spiralmuster. Nachdem Sie die Haut etwa eine Minute trocknen lassen, drücken Sie eine sterile Sechs-Millimeter-Stanzbiopsie in der Mitte des vorbereiteten Operationsbereichs fest.
Drehen Sie die Punschbiopsie, um eine kreisförmige Kontur auf der Haut zu erstellen, die vollständig durch das Hautgewebe schneidet, und mindestens einen Abschnitt des Umrisses. Achten Sie darauf, nicht in die darunter liegende Faszien oder Gewebe zu schneiden. Dann verwenden Sie sterile Schere, und Zange, um durch die Epidermis und Dermis zu schneiden, nach dem kreisförmigen Muster durch die Punschbiopsie geprägt.
Für die Staph aureus-Impfung eine 28 Gauge Insulinspritze mit 50 Mikrolitern des hergestellten biolumineszierenden bakteriellen Inokulmittels füllen. Und mit einem Finger die Dermis des verwundeten Tieres zur Seite ziehen. Halten Sie die Spritze fast parallel zum Gewebe, setzen Sie die Spritze langsam in das Gewebe ein, bis eine plötzliche Abnahme des Widerstands zu spüren ist.
Anzeige des Piercings der Faszien. Mit der Nadel in der Mitte der Wunde platziert, liefern Sie langsam das gesamte Volumen des Inoculant. Bestätigen Sie, dass das Inokulator eine Blase in der Mitte der Wunde bildet, mit minimaler Leckage oder Dispersion.
Und entfernen Sie die Spritze langsam vom Tier. Dann kehren Sie das Tier in seinen Käfig mit Wärme und Überwachung bis zur vollständigen Genesung zurück. Nach Der Wunde und Infektion, und täglich während des Experiments, legen Sie die anästhesierte Maus in eine biolumineszierende und Blütenszenz-Bildr, mit der Wunde so flach wie möglich.
Wählen Sie in der Imager-Software Lumineszenz und Foto als Bildverarbeitungsmodi aus. Die Belichtungszeit sollte bei kleinem Binning auf eine Minute voreingestellt, F/Stop 1 für Lumineszenz, F/Stop 8 für die Fotografie und für den Emissionsfilter geöffnet werden. Klicken Sie dann auf Abrufen, um das Bild aufzuzeichnen.
Wählen Sie für die In-vivo-Fluoreszenz-Bildgebung Fluoreszenz und Fotografie als Bildgebungsmodi aus. Die Belichtungszeit sollte bei kleinem Binning auf eine Sekunde, F/Stop 1 für Fluoreszenz, F/Stop 8 für Die Fotografie und Anregungs- und Emissionswellenlängen von 465 über 30 Nanometern und 520 über 20 Nanometern mit einer hohen Lampenintensität voreingestellt werden. Klicken Sie dann auf Abrufen, um das Bild aufzuzeichnen.
Nachdem Sie beide Bildersätze erhalten haben, bringen Sie das Tier mit Überwachung in seinen Käfig zurück, bis es vollständig wiedergenesen ist. Öffnen Sie für die Bildanalyse das zu quantifizierende Bild in einem geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramm, und platzieren Sie den standardmäßigen kreisförmigen Bereich, der für den gesamten Wundbereich einschließlich der umgebenden Haut von Interesse ist. Klicken Sie auf Denzinsbereich messen, und erfassen Sie die Werte für den mittleren Fluss für die Wunde, damit der mittlere Fluss jedes Signals im Vergleich zur Zeit dargestellt werden kann.
Um die Wundheilung zu messen, passen Sie einen kreisförmigen Bereich von Interesse über die Wundkante, und messen Sie die Fläche der Wunde in Zentimetern quadratisch, um die Darstellung der Bruchänderung von der Basislinie im Vergleich zur Zeit zu ermöglichen. In diesem repräsentativen Experiment zeigte die bedingte EGFP-Expression myeloische Differenzierung primäre Reaktion 88, oder MyD88 Knockout-Mäuse, eine größere Anfälligkeit für Staph aureus-Impfung, als nicht bedingte EGFP-extierende Tiere. Mit einer 80%tödlichen Infektin während der ersten acht Tage der Infektion.
Beide Mäusestämme verloren unmittelbar nach der Infektion etwa 5% ihres Körpergewichts. Das bedingte EGFP, das Mäuse ausdrückte, erholte sich jedoch am zweiten Tag wieder. Während die MyD88 Mäuse nicht.
Wundverschluss in Gegenwart von Staph aureus Infektion war nicht unterschiedlich zwischen den beiden Stämmen. Jedoch, steril verwundet MyD88 Knockout Mäuse, hatte einen signifikanten Defekt in der Wundheilung, im Vergleich zu bedingten EGFP exsetierenden Tieren. Ganze Tierbilder zeigten eine höhere bakterielle Belastung, wie ein erhöhtes biolumineszierendes Signal in den Wunden von MyD88 Knockout-Tieren zeigt, im Vergleich zu bedingten EGFP-exezierenden Tieren.
Ein Rückgang des anfänglichen Neutrophilenhandels auf nicht infizierte Wunden von MyD88-Knockout-Tieren um 40 % wurde im Vergleich zu bedingten EGFP-Exemittieren beobachtet. Als 1 x 10 bis zur 7. Kolonie bildende Einheiten von Staph aureus unmittelbar nach der Verwundung eingeführt wurden, wurde der Neutrophilenhandel bei Knockout-Tieren im Vergleich zu bedingten EGFP-ausdrückenden Tieren signifikant abgeschwächt. Stellen Sie vor dem Dosieren der Bakterien sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden und dass die Position der Nadel korrekt in der Mitte der Wunde positioniert ist.
TierischeGewebe können am Endpunkt geerntet werden, um die Expression von Proteinen von Interesse und die bakterielle Verbreitung aus der Wunde zu messen. Staph aureus ist für den Menschen ansteckend. Daher sollten persönliche Schutzausrüstungen beim Umgang mit den Bakterien getragen werden, und beim Umgang mit einer Spritze, die den Erreger enthält, ist Vorsicht geboten.
Diese Technik hat dazu beigetragen, die Verwendung von biologischen Behandlungen für Staph aureus Infektionen zu erforschen, die die Wirte angeborene Immunantwort gegen Infektionen zu verbessern.
