Die Toxizitätstests werden von Dr.Ashok Aspatwar, einem leitenden Forscher aus meinem Labor, demonstriert. Unser Protokoll identifiziert Off-Target-Effekte und erkennt subtile toxische Wirkungen von Chemikalien in der frühen Phase der Entdeckung, die in der Zellkultur oder anderen Tiermodellen übersehen werden können. Die Hauptvorteile unserer Technik sind: Sie ist schnell und effizient, erfordert sehr wenig Chemikalien und die Grundausstattung im Labor.
Das Toxizitätsscreening wird uns bei der Entscheidung über die Konzentration für die Untersuchung ihrer Effizienz gegen Mykobakterien, die Tuberkulose verursachen, und für eine weitere präklinische Berechnung helfen. Diese Methode verwendet Einblicke in off-target-Effekte von Chemikalien, und daher kann diese Methode in jedem Bereich der Forschung verwendet werden, wo die Toxizität der Chemikalie von primärer Bedeutung ist. Diese Methode ist sehr einfach und kann von jedem ohne vorherige Erfahrung durchgeführt werden.
Personen ohne Erfahrung sollten das Experiment sorgfältig planen und nur eine Verbindung verwenden. Diese Methode liefert toxische Wirkungen der Chemikalien in Form von phänotychen Veränderungen in den sich entwickelnden Zebrafischembryonen und damit Sicherheit der getesteten Verbindungen. Um zu beginnen, legen Sie zwei bis fünf erwachsene männliche Zebrafische und drei bis fünf erwachsene weibliche Zebrafische über Nacht in Paarungsbecken.
Am Morgen schalten Sie das Licht ein, da die Brut durch den automatischen Dunkel- und nachfolgenden Lichtzyklus induziert wird. Um den Umgang mit Stress für die Tiere zu vermeiden, lassen Sie die Tiere für zwei Wochen ruhen, bevor Sie die gleichen Individuen für die Zucht verwenden. Am nächsten Tag vor Mittag die Embryonen mit einem feinen Netzsieb sammeln und auf eine Petrischale mit E3-Embryomedium übertragen.
Legen Sie die Petrischale unter ein Stereomikroskop, um jede Charge von Embryonen zu untersuchen. Identifizieren Sie das undurchsichtige Erscheinungsbild und entfernen Sie es als unbefruchtete oder tote Embryonen. Halten Sie die Embryonen über Nacht bei 28,5 Grad Celsius in einem Brutkasten.
Am nächsten Morgen untersuchen Sie die Embryonen unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie alle ungesunden oder toten Embryonen. Verwenden Sie vorsichtig eine Pasteurpipette, um einen Embryo in jeden Brunnen einer 24-Well-Platte zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass jeder Brunnen genügend E3-Medium enthält, um die Embryonen abzudecken.
Nehmen Sie die Fläschchen mit Inhibitorverbindungen bei 4 Grad Celsius im Kühlschrank gespeichert. Verwenden Sie eine analytische Waage, um die entsprechende Menge der Verbindung zu wiegen, und bereiten Sie 250 Mikroliter 100 Millimolar-Lagerlösung für jede Verbindung in E3 medium oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel vor. Verwenden Sie dann E3 medium, um serielle Verdünnungen der Lagerlösungen auf der Grundlage von Toxizitätsniveaus in 15 Milliliter Zentrifugenrohren herzustellen.
Aus den Brunnen, die jeweils einen DPF-Embryo enthalten, verwenden Sie eine Pasteurpipette und 1 Milliliter Pipette, um das E3-Wasser eine Reihe nach dem anderen zu entfernen. 1 Milliliter jedes Verdünnungsstoffs der Lagerlösungen sofort in die Brunnen der 24 Brunnenplatte verteilen, beginnend mit niedrigerer und höherer Konzentration. Für die Kontrollgruppen E3-Wasser oder ein anderes relevantes Lösungsmittel hinzufügen.
24 Brunnenplatten mit dem Namen und der Konzentration der Verbindung beschriften und die Platten bei 28,5 Grad Celsius in einem Inkubator aufbewahren. Achten Sie darauf, dass die Verdünnungsmittel der Chemikalien in den Brunnen nicht im Inkubator verdampft werden, indem die Seiten von 24 Brunnenplatten versiegelt werden. Vierundzwanzig Stunden nach der Exposition der chemischen Verbindungen verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die Larven, die jeder Konzentration der Verbindung ausgesetzt sind, in eine kleine Petrischale zu übertragen, die 3% methylierte Methylcellulose mit hohem Molekulargewicht enthält.
Mit einer Metallsonde seitlich legen. Legen Sie die Petrischale unter ein Stereomikroskop, das an einer Kamera befestigt ist. Nehmen Sie die Bilder auf, und speichern Sie die Bilder jeden Tag bis zum Ende des Experiments in einem separaten Ordner.
Geben Sie alle Beobachtungen in einer Tabelle jeden Tag entweder in einer Onlinetabelle oder auf einem gedruckten Blatt ein. Bei neurotoxischer Zusammengesetztenexposition können die vier bis fünf DPF-Larven ein abnormales Schwimmmuster aufweisen. In diesem Fall, machen Sie eine Aufzeichnung solcher Änderungen, indem Sie eine kurze 30 Sekunden bis eine Minute Video der Larven.
Beachten Sie nach fünf Tagen Exposition gegenüber den chemischen Verbindungen die Konzentration, bei der die Hälfte der Embryonen als die halbmaximale tödliche Konzentration 50 jeder Chemikalie stirbt. Konstruieren Sie eine Kurve für die Sterblichkeit von Embryonen für alle Konzentrationen mit einem geeigneten Programm. In diesem Protokoll ist der entscheidende Teil der Bewertung der Toxizität die Prüfung verschiedener Konzentrationen einer oder mehrerer chemischer Verbindungen in einem einzigen Experiment.
Bei den Verbindungen, die phänotische Defekte in den Larven hervorrufen, wurden die Defekte alle 24 Stunden über den Zeitraum von ein bis fünf Tagen nach der Exposition gegenüber der Chemikalie aufgezeichnet. Die mit Beta-CA-Inhibitoren behandelten Embryonen in den Konzentrationen von 250 Mikromolaren und 125 Mikromolaren weisen im Vergleich zur Kontrolle verschiedene phänotypische Defekte auf. Zum Beispiel, ungeschlüpfte Embryonen auch an Tag 3, gekrümmte Körperstruktur, ungenutzte Dottersack und Perikardödem, und Abwesenheit von Otolith-Säcken in den Larven an fünf Tagen nach der Behandlung.
In einer anderen Studie zeigten die mit CA-Hemmern behandelten Embryonen das Fehlen von Otolithsäcken und Schwimmblase. Die Experimente identifizierten eine repräsentative Verbindung Kohlensäure anhydrase 9, die minimale oder keine phänotypischen Veränderungen während der embryonalen Entwicklung bei 500 Mikromolar induzierte. Die Verbindung zeigte eine hohe LC50-Konzentration.
Jedoch, in einem Vergleich mit einer Kontrolle, die gleiche Verbindung bei 300 Mikromolar wurde festgestellt, dass neurotoxisch und induzierte Ataxie in den Larven nach fünf Tagen der Exposition. Eine gute Qualität der Embryonen ist wichtig für das Toxizitätsscreening von Chemikalien. Um qualitativ hochwertige Embryonen zu erhalten, verwenden Sie junge Paare von erwachsenen Zebrafischen für die Zucht.
Die Verbindungen, die als sicher entstehen, können durch relevante In-vitro- und In-vivo-Experimente weiter charakterisiert werden. Im Bereich der Entwicklung von Antituberkulosemedikamenten half diese Technik, weitere Experimente zur In-vivo-Hemmung von Mycobacterium marinum in Zebrafischembryonen zu entwickeln. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von Chemikalien, die für den Menschen giftig sein können.
Die an den Experimenten beteiligten Personen sollten beim Umgang mit den Chemikalien auf passende Vorsicht achten.
