Die Erforschung der Protein-Protein-Interaktion ist für das Verständnis physiologischer Prozesse in mehreren Bereichen unerlässlich. In diesem Video stellen wir die On-Membran-Verdauungstechnik vor, die es den Forschern ermöglicht, eine umfassende Analyse von Bindungsproteinen durch MS auf bequeme Weise durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir den Durchsatz der proteomischen Analyse für rohe Immunpräzipitantien verbessern können, da eine Trennung von Proteinen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese nicht erforderlich ist.
Beginnen Sie, den Antikörper mit den magnetischen Perlen zu konjugieren, indem Sie den Anti-GFP-Antikörper mit den Perlen in 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer mischen. Drehen Sie das Gemisch bei 50 Umdrehungen für eine Stunde bei Raumtemperatur. Und dann die konjugierten Perlen dreimal mit Citratphosphatpuffer mit 1%Polysorbat 20 waschen.
Lyse transfizierte Zellen nach Manuskriptrichtungen. Die Schale zerkleinern und in das 1,5-Milliliter-Reagenzglas geben. Dann das Lysat durch Zentrifugieren bei 15.000 x g für fünf Minuten löschen und den Überstand sammeln.
Bereiten Sie unbeschriftete Magnetperlen vor, indem Sie sie dreimal mit 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer waschen. Nach der letzten Wäsche den Puffer entfernen und den Perlen Zelllysat hinzufügen. Drehen Sie das Gemisch bei 50 Umdrehungen 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Führen Sie die magnetische Trennung auf dem magnetischen Ständer durch und sammeln Sie das Zelllysat. Um die Zielproteine an die immunglobulin konjugierten Perlen zu binden, legen Sie die Perlen fünf Minuten lang auf den magnetischen Ständer. Entsorgen Sie den Citratpuffer, und fügen Sie das Zelllysat zu den Perlen hinzu.
Drehen Sie die Mischung für eine Stunde bei 50 RPM. Um Zielproteine von den freien Nichtzielproteinen zu trennen, waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer, der 1%Polysorbat 20 enthält. Nach der letzten Wäsche 30 Mikroliter Citratpuffer hinzufügen und die Perlen fünf Minuten bei Raumtemperatur sitzen lassen, um die Zielproteine zu löschen.
Zur Vorbereitung der Membran schneiden Sie PVDF-Membranen mit einer chirurgischen Schere in 3-Millimeter-Stücke, die unmittelbar vor dem Gebrauch gereinigt wurden. Legen Sie die Membranstücke auf Aluminiumfolie und fügen Sie zwei bis fünf Mikroliter Ethanol zu jedem Stück hinzu. Bevor die Membranen vollständig trocken sind, fügen Sie jedem Stück zwei bis fünf Mikroliter des Proteins eluent hinzu und trocknen Sie es an der Luft, bis die Membranoberfläche matt wird.
Dann Membranen in 1,5 Milliliter-Rohre übertragen und bei vier Grad Celsius lagern. Wenn Sie sofort verwenden, fügen Sie zwei bis 30 Mikroliter Ethanol hinzu, was sie hydrophil macht. Entfernen Sie das Ethanol mit einer Pipette, aber bevor die Membranen trocknen, fügen Sie 200 Mikroliter DTT-basierte Reaktionslösung zu jeder Röhre vollständig hinzu und inkubieren Sie sie bei 56 Grad Celsius für eine Stunde.
Nach der Inkubation die Reaktionslösung durch 300 Mikroliter Iodoacetamid-Lösung ersetzen und 45 Minuten im Dunkeln brüten. Dann waschen Sie die Membranen zweimal mit destilliertem Wasser und einmal mit 2%Acetonitril durch Wirbeln für mindestens zehn Sekunden. Die Arbeit mit diaphanem astonititrillösen kann extrem gefährlich sein.
Eine Maske, eine Brille und Handschuhe sollten immer getragen werden, wenn die On-Membran-Verdauung durchführen. Bereiten Sie Trypsin nach Manuskriptanweisungen vor und fügen Sie jeder Membran 100 Mikroliter Trypsin-Reaktionslösung hinzu. Über Nacht bei 37 Grad Celsius zur Verdauung inkubieren.
Übertragen Sie am nächsten Tag die Reaktionslösung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Rohr und fügen Sie der Membran 100 Mikroliter Waschlösungen hinzu. Die Membran zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius inkubieren, dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen. Fügen Sie der Membran weitere 100 Mikroliter Waschlösung hinzu und beschallen Sie sie 10 Minuten lang.
Dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen. Bedecken Sie das Reagenzglas mit einem Stück Laborfolie und machen Sie kleine Löcher in der Folie mit einer Nadel. Trocknen Sie die Lösung mit einem Vakuumkonzentrator, und lösen Sie den Rückstand in 10 Mikroliter 2%Ameisensäure auf.
Zentrifugieren Sie das Rohr drei Minuten lang bei 12.000 x g und übertragen Sie den Überstand in ein Probenrohr. Analysieren Sie die Probe mit einem Massenspektrometer, das mit einem Nano-LC/HPLC-System verbunden ist. Mit diesem Protokoll wurden 17 Proteine im Calpain-6-assoziierten Immunpräcipitant identifiziert, 15 im GFP-assoziierten Immunpräcipitant und 11 in beiden.
Es ist wichtig zu beachten, dass der Nachweis von mindestens einem High-Fidelity-Peptid-Fragment für die positive Identifizierung eines Kandidatenproteins erforderlich ist. Proteine, die im GFP-exzessigraphischen Lysat ausfielen, sowie Histonen, exogene und ribosomale Proteine wurden von der Liste gestrichen. Das Waschen der Membranen vor der tryptischen Verdauung mit destilliertem Wasser und 2%Acetonitril ist der wichtigste Schritt bei der Behandlung der On-Membran-Verdauung über Proteine.
Nach dieser Methode ist es möglich, die Ko-Ausfällung des Zielproteins durch andere Experimente wie Immunpräzipitation und Western Blot-Analyse zu bestätigen. Diese einfache Methode ermöglicht es den Forschern, die neuartigen Protein-Protein-Wechselwirkungen mit bequemen und hochempfindlichen Analysen zu erforschen.
