Die Autoren bedanken sich bei Eleanor Fleming und Jessica Chen für hilfreiche Diskussionen danken. Die Finanzierung wurde von National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH-NIAID) Award R15AI079685 und ein Research Corporation Cottrell Hochschule Science Award zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Unterstützung der Studierenden wurde von der Howard Hughes Medical Institute und der Staley Fonds zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung der große unilamellare Lipidvesikeln (LUVs) <ol><li> Bereiten LUVs zu dienen als Zellmembran imitiert für den Test 19. </li><li> Mix Phosphatidylcholin (POPC, 760,10 g / mol), Phosphatidylglycerin (POPG. 770,99 g / mol), 5-Dimethylamino-1-sulfonyl Phosphatidylethanolamin (DNS-PAPST, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) in Chloroform in einem 50 aufgelöst : 45:5-Verhältnis. Wie in jedem Test erfordert die separate Herstellung der beiden Experimental-und Kontrollgruppe LUVs, sollten zwei Lipid-Kuchen Durchstechflaschen hergestellt werden. 0,376 mg Gesamt-Lipid (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG, und 0,019 mg DNS-PAPST) ist in der Regel ausreicht, um genügend Vesikel für eine einzelne Translokation Versuch zu machen. </li><li> Abdampfen Chloroform mit einem N 2 Gasstrom. </li><li> Trocknen Sie die Lipid-Kuchen 9-14 Stunden in einem Vakuum-Exsikkator. </li><li> Bereiten Sie ein Lager 10 mM HEPES-Puffer-Lösung (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). HEPES Puffer stZe bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,4 mM Schwein Trypsin (23,3 kg / mol) in 10 mM HEPES-Puffer über. Trypsin wird bei -20 ° C gelagert und in unserer Praxis, in der Regel nicht unterziehen mehr als 2 Frost-Tau-Zyklen vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 4,0 mM Bowman-Birk-Trypsin-Inhibitor (8 kg / mol) in 10 mM HEPES-Puffer-Lösung und bei -20 ° C. In unserer Anwendung ist dieses Lager wieder aufgefüllt monatlich und in der Regel nicht unterziehen mehr als 3 Frost / Tau-Zyklen, bevor es wieder hergestellt wird. </li><li> Rekonstituieren experimentellen multilamellare Vesikel (MLV) in einer 0,2 mM Trypsin-Lösung durch Zugabe eines gleichen Volumens von 0,4 mM Trypsin Lager und 10 mM HEPES-Puffer-Lösung auf die getrocknete Lipid Kuchen. Für eine einzelne Probe von 0,376 mg Gesamt-Lipid, ist eine Mischung aus 150 ul Trypsin-Lösung und 150 ul HEPES-Puffer ausreichen. </li><li> Rekonstituieren Kontrolle MLVs in einer Lösung mit 0,2 mM Trypsin und 2,0 mM Bowman-Birk-Trypsin-Inhibitor durch Zugabe eines gleichen Volumens von 0.4 mM Trypsin Lager und 4,0 mm-Trypsin-Inhibitor auf die getrocknete Lipid Kuchen. Für eine einzelne Probe von 0,376 mg Gesamt-Lipid, ist eine Mischung aus 150 ul Trypsin-Lösung und 150 &amp;mgr; l Trypsin Inhibitor ausreichend. </li><li> Transfer-MLV-Lösungen von Glasflaschen auf 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Subject MLV-Lösungen bis 5 Frost / Tau-Zyklen in flüssigem Stickstoff. </li><li> Bereiten Lipid Extruder (Avanti Polar Lipids), indem man zwei Filter unterstützt angefeuchtet in HEPES-Puffer auf jedem Teflon Extruder Stück. Legen Sie eine Nuclepore track geätzten Membran mit 0,1 um Poren (Whatman, United Kingdom) zwischen den beiden Teflon Extruder Stücke, und statt der Extruder Stücke in der Metall-Extruder Kanister. Setzen Sie den Donut spacer über die beiden Extruder Stücke vor dem Anziehen der Metall-Spitze des Extruders Kanister und stellen Sie es in die Halterung ein. </li><li> Füllen Sie das Hohlraumvolumen innerhalb des Extruders mit 500 ul 10 mM HEPES-Puffer mit einer 250 ul Glasspritze zum Verlust der Vesikel Probe zu verhindern. &lt;/ Li&gt; <li> Legen Sie jedes MLV Probe in den Extruder und drücken Sie die Probe durch die Membran mindestens 21 Mal, um eine einheitliche unilamellare Vesikelgröße gewährleisten. LUVs aus dem MLV-Lösung nach der Extrusion erhalten. </li><li> Shop LUVs bei 4 ° C lagern und innerhalb von 48 Stunden. </li></ol> 2. Die Quantifizierung der LUV Konzentration <ol><li> LUV-Konzentration wurde durch die Bestimmung der Gesamt-Phosphor-Gehalt in der Probe 20 quantifiziert. </li><li> Bereiten 8,9 NH 2 SO 4 in Nanopure Wasser und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Bereiten Sie eine 2,5% w / v Ammoniummolybdat VI (588,04 g / mol)-Lösung in Nanopure Wasser. Bereiten Sie eine 10% w / v Ascorbinsäure (176,1 g / mol)-Lösung in Nanopure Wasser. Schützen Sie die Ascorbinsäure-Lösung von Belichtung durch Abdecken des Rohres mit einer Folie. Shop-Lösungen sowohl bei 4 ° C für bis zu 2 Monate. </li><li> Bereiten 0,65 mM Phosphat-Puffer-Lösung (einbasischen wasserfreien Natriumphosphat, 120 g / mol). </li><li> Bereiten Sie sechs Standard-tuBes. Standards enthalten sollte 0,0 ul, 50 ul (0,0325 umol), 100 ul (0,065 umol), 175 ul (0,114 umol), 250 ul (0,163 umol), oder 350 ul (0,228 umol) von Phosphor-Lösung. </li><li> Bereiten Sie LUV Probenröhrchen in dreifacher Ausfertigung. Jedes Probenröhrchen enthalten sollte ungefähr 0,1 umol LUVs. Experimental-und Kontrollgruppe LUV Konzentrationen muss separat gemessen werden. </li><li> Zur Korrektur einer getrockneten Phosphor-Salzen in der Bowman-Birk-Inhibitor Pulver, LUV ein Steuerelement leer vorbereitet werden müssen. Der Rohling sollte das gleiche Volumen der 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk-Inhibitor-Lösung wie in der Kontrolle gestellt Probenröhrchen LUV. </li><li> Legen Sie 450 ul von 8,9 NH 2 SO 4 in jeder der Probe, Standard und leere Röhrchen. </li><li> Hitze-Proben, Standards und Rohlinge für 25 Minuten bei 175-210 ° C in einem Ofen. </li><li> Entfernen Sie alle Schläuche und abkühlen lassen. Add 150 ul 30% H 2 O 2 zu jedem der tuBes. </li><li> Hitze-Proben, Standards und Rohlinge für 30 Minuten bei 175-210 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Proben, Standards und Blindproben vor Hitze. Wenn eine der Lösungen noch nicht farblos, mit 50 ul H 2 O 2, das alle Rohre und Wärme für weitere 15 Minuten bei 175-210 ° C. </li><li> Add 3.9 mL Nanopure H 2 O, 0,5 ml Ammoniummolybdat-Lösung und 0,5 ml Ascorbinsäure-Lösung in jedes Röhrchen. </li><li> Hitze alle Rohre für 5-7 Minuten in ein kochendes Wasserbad. </li><li> Messen Sie die Absorption der einzelnen Standard-und Probe bei 820 nm mit Hilfe eines Agilent 8453 UV-VIS Spektralphotometer. Die Röhrchen mit 0,0 mmol Phosphor sollte als Rohling für alle Standards und experimentelle verwendet werden LUV Proben. Das Rohr mit dem 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk-Inhibitor-Lösung sollte als Rohling für die Steuerung verwendet werden LUV Probe. </li><li> Eine lineare Absorption vs Phosphorgehalt Standardkurve erzeugt und verwendet werden, um die gesamte phosph berechnenorus Inhalt und LUV-Konzentration der Proben. </li></ol> 3. Vorbereitung Peptide Lösungen <ol><li> Lösen Peptid in Nanopure H 2 O. Peptide in diesem Test verwendet, wie beschrieben muss einen Tryptophan-Rest. </li><li> Messen Sie die Absorption der Peptid-Lösung bei 282 nm in dreifacher Ausfertigung. Berechnen Peptidkonzentration unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für Tryptophan von 5700 M -1 cm -1. </li><li> Verdünnen Peptid in Nanopure Wasser bis zu einer Endkonzentration von 30 uM. Lagerung bei -20 ° C </li></ol> 4. Translokation Quantifizierung <ol><li> Bereiten Experimental-und Kontrollgruppe Proben in 1,7 ml Reaktionsgefäße. Fügen Sie genug LUVs jeder Lösung für eine endgültige Konzentration von 250 uM. Fügen Sie genug Bowman-Birk-Inhibitor-Lösung, so dass Inhibitor ist ein Endkonzentration 10x größer als die Trypsin-Konzentration. Fügen Sie genug 10 mM HEPES-Puffer für die endgültige Lösung Volumen von 450 ul zu bringen. </li> &lt;li&gt; Platz 50 ul Peptid-Lösung in eine Starna micro Quarz Fluorometer Zelle. Das Verhältnis zwischen LUVs und Peptid ist hoch genug, um sicherzustellen, dass praktisch alle intakten Peptide in nahe genug Nähe zu einem Dansyl-Gruppe zu geben, ein FRET-Signal, auch wenn keiner in die Vesikel haben transloziert. Dies steht im Einklang mit dem ähnlichen FRET in der Steuerung für Peptide, und sie nicht in Vesikeln translozieren beobachtet. </li><li> Fügen Sie die experimentelle oder Kontrollprobe, die Peptid-Lösung in der Küvette. Dies sollte die endgültige Peptid-Konzentration bis 3 um. </li><li> Beginnen Sie eine 25-minütige fluoreszierende Kinetik Experiment sofort nach Zugabe von experimentellen oder Kontrolle LUV Lösung unter einem Fluoreszenz-Lektüre mindestens einmal pro Sekunde. Stellen Sie die Anregungswellenlänge bei 280 nm, die Emissionswellenlänge bei 525 nm, und die Temperatur auf 25 ° C. Mit einem Cary-Eclipse-Fluoreszenz-Spektralphotometer, setzen wir die PMT-Empfindlichkeit zu hoch. </li></ol><html> 5. Generieren eines Quantitative Translokation Verhältnis <ol><li> Definieren Sie zunächst Fluoreszenz (F o) wie die Fluoreszenz-Anzeige nach 15 Sekunden der Datenerhebung. In unserem Instrument Setup haben wir festgestellt, dass die ersten 15 Sekunden der Fluoreszenz gesammelten Daten unzuverlässig sind durch Mischen, Schließen der Probenkammer und andere Störungen auf das System nach Zugabe der Probe. Teilen Sie jede weitere Lesung von F o die relative Fluoreszenz (F / F 0) zu jedem Zeitpunkt zu erhalten. </li><li> Durchschnitt aller relativen Fluoreszenz Lesungen aus der letzten Minute des Experiments auf eine endgültige durchschnittliche relative Fluoreszenz <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Teilen Sie die <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> für die Kontrollproben von der <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> für experimentelle Proben zu erhalten, eine korrigierte endgültige Fluoreszenz-Wert. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse dieses Tests für eine repräsentative Peptid, das robust Translokation zeigte. Das Signal in diesem Experiment (schwarze Kurve) zeigt einen deutlichen Rückgang in FRET-Signals über die Zeit. Allerdings ist es wichtig, für den potenziellen Verlust von FRET-Signals aufgrund unvollständiger Trypsin-Hemmung oder andere Faktoren, die nicht die Translokation Fähigkeit zu kontrollieren. Zu diesem Zweck haben wir immer auch die Messung der FRET-Signals zwischen Peptid und LUVs, die sowohl Trypsin und Bowman-Birk-Trypsin-Inhibitor (graue Kurve, Abbildung 2). In unseren Händen hat es wichtig, diese Kontrolle für jeden Peptids führen jedes Mal ein Experiment ausgeführt wird. Dies ermöglicht es uns, klar für Änderungen in Signal wegen etwaiger Differenzen zwischen Lipidvesikel Zubereitungen oder Instrument Lärm, die erheblich sein können für die relativ schwache Fluoreszenzsignale typischerweise bei diesen Konzentrationen beobachtet zu korrigieren. Die Bedeutung der Kontrolle Erfahrungenriment mit LUVs mit Trypsin-Inhibitor wird durch die Daten in Abbildung 3 dargestellt hervorgehoben. In diesem Fall verringert das Peptid-Signal eine ähnliche Menge wie in Abbildung 2 in der experimentellen Probe (schwarze Kurve). Doch der Kontrollprobe eine schnelle Abnahme für dieses Peptid zeigt, so die Netto-Translokation ist geringer. Abschnitt 5 unserer Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung Translokation aus diesem Experiment. Höhere Translokation Verhältnisse sind bezeichnend für Peptide, die effizient transloziert, die Translokation Verhältnis für die Zelle eindringende Peptid in Abbildung 2 dargestellt ist 1,16, während schwach transportiert Peptide Translokation Verhältnisse haben näher an 1. Nach unserer Erfahrung ist der Standardfehler für drei unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Vesikel Vorbereitungen durchgeführt im Bereich von 0,01 bis 0,06. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der translocatIonen-Assay. Experimental LUV Proben (A) sind mit fluoreszierenden Dansyl PAPST (schwarze Balken) dotiert und gekapselt Trypsin (Schere) enthalten. Trypsin-Inhibitor (roter Kreis) wird verwendet, um Trypsin außerhalb der LUVs hemmen. Die LUVs sind Peptid (lila) ausgesetzt. Peptide gemeinsam mit LUV Membranen ergibt sich ein FRET-Signal (grün), die als translocting Peptide Begegnung ungehemmten internen Trypsin abnimmt. Sowohl Trypsin und Trypsin-Inhibitor sind in der Steuerung gekapselt LUV Proben (B) zu einer Abnahme in FRET-Signals in keinem Zusammenhang mit Translokation zu messen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Daten für eine zellpenetrierendes Peptid. Ein Vertreter translozierenden antimikrobielle pepide zeigt einen deutlichen Rückgang bei FRET-Signals im Vergleich zu ihrer Kontrolle. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Abbildung3. Repräsentative Daten unterstreichen die Bedeutung der Kontrolle. Unvollständige Hemmung der tryptischen Verdau eines nicht-translozierenden Peptid führt zu einem Rückgang der FRET-Signals über die Zeit in beiden Versuchs-und Kontrollgruppen LUV-Lösungen. Da der Unterschied zwischen der Steuerung und experimentellen Spuren relativ klein ist, ist diese Mutante als schwach translozierenden Peptid charakterisiert.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll hier vorgestellten verwendet werden, um die relative Veränderung der Konzentration von Peptiden innerhalb und außerhalb von Lipidvesikeln beurteilen. Diese Änderungen werden Translokation Fähigkeit verbunden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Zell-penetrierende Peptide mit Potenzial als Drug-Delivery-Vektoren zu identifizieren. Da das Interesse in Zell-penetrierende Peptide wächst, wird es interessant sein zu sehen, wie Methoden, die direkt die Translokation entwickelt und in einer quantitati...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 16.00 bis 18.01 Uhr PG </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01.18 Dansyl PE </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16.00 bis 18.01 Uhr PC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Porcine Trypsin </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk Trypsin / Chymotrypsin-Inhibitor </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-Extruder </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Ammoniummolybdat (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L-Ascorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid, 30% ige Lösung </td><td> Mallinckrodt Chemikalien </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

Es gibt ein aktives Interesse an Peptiden, die leicht Zellmembranen ohne die Hilfe von Zellmembran-Rezeptoren 1. Viele von ihnen sind als Zell-penetrierende Peptide, die häufig auf ihr Potenzial als Drug-Delivery-Vektoren 1-3 sind vermerkt bezeichnet. Darüber hinaus gibt es zunehmendes Interesse an antimikrobiellen Peptiden, die über nicht-Membran lytische Mechanismen 4,5, insbesondere jene, die bakteriellen Membranen voraussichtlich nicht durchdringt, ohne dass Zell-Lyse und töten Zellen durch Eingriffe in intrazellulären Prozessen 6,7 betreiben. In der Tat haben Autoren zunehmend die Beziehung zwischen zellpenetrierendes und antimikrobielle Peptide 1,8 hingewiesen. Ein tiefgehendes Verständnis des Prozesses der Membran-Translokation und die Beziehung zwischen Peptid-Struktur und seine Fähigkeit, translozieren erfordert eine effektive und reproduzierbare Tests für die Translokation. Mehrere Gruppen haben Methoden zur Translokation in großen unilamel vorgeschlagene Maßnahmelar Lipidvesikel (LUVs) 9-13. LUVs dienen als nützliche Modelle für bakterielle und eukaryontische Zellmembranen und sind häufig in der Peptid-Fluoreszenz-Studien 14,15 verwendet. Hier beschreiben wir unsere Anwendung der Methode zuerst von Matsuzaki und Mitarbeiter entwickelt, um antimikrobielle Peptide, wie Magainin und Buforin II 16,17 berücksichtigen. Neben der Bereitstellung von unserem Protokoll für diese Methode, stellen wir auch eine einfache Ansatz zur Datenanalyse, die Translokation Fähigkeit mit diesem Assay quantifiziert. Die Vorteile dieser Translokation Assay im Vergleich zu anderen sind, dass sie das Potenzial, um Informationen über die Rate der Membran Translokation bieten und erfordert nicht die Zugabe eines fluoreszierenden Markierung, die verändern Peptid Eigenschaften können 18, an Tryptophan-haltige Peptide hat. Kurz gesagt, ist die Translokation Fähigkeit in Lipidvesikel als Funktion der Foster Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen einheimischen Tryptophan und d gemessenansyl Phosphatidylethanolamin, wenn die Proteine ​​mit der externen assoziiert sind LUV-Membran (Abbildung 1). Cell-penetrierende Peptide gespalten werden, wie sie hemmungslos Trypsin mit dem LUVs gekapselt Begegnung führt zu Entfremdung von der LUV-Membran und einem Rückgang der FRET-Signals. Der Rückgang der FRET-Signals für eine Translokation Peptid beobachtet wird deutlich größer als die für das gleiche Peptid, wenn die LUVs sowohl Trypsin und Trypsin-Inhibitor, oder wenn ein Peptid, das nicht spontan funktioniert cross Lipidmembranen ist Trypsin-haltigen LUVs ausgesetzt enthalten beobachtet. Diese Änderung in der Fluoreszenz bietet eine direkte Quantifizierung der Peptid-Translokation über die Zeit.

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Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Dieses Protokoll Details eine Methode zur quantitativen Messung von Peptid-Translokation in große unilamellare Lipidvesikel. Diese Methode liefert auch Informationen über die Geschwindigkeit der Membran-Translokation und kann verwendet werden, um Peptide, die effizient und spontan Kreuz Lipid-Doppelschichten zu identifizieren.

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

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Biology

13.8K Aufrufe.  Wellesley College. Dieses Protokoll Details eine Methode zur quantitativen Messung von Peptid-Translokation in große unilamellare Lipidvesikel. Diese Methode liefert auch Informationen über die Geschwindigkeit der Membran-Translokation und kann verwendet werden, um Peptide, die effizient und spontan Kreuz Lipid-Doppelschichten zu identifizieren.

Serie: Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Forschung

Biologie

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Untersuchen BCL-2 Family Funktion mit großen unilamellaren Vesikeln

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...