ADH und FAD sind endogene Moleküle, die Autofluoreszenz bei unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen aufweisen. Aufgrund ihrer Verwendung als Co-Enzyme von Stoffwechselreaktionen kann die Autofluoreszenzmikroskopie den Zellstoffwechsel beurteilen. Die Autofluoreszenzbildgebung von NADH und FAD erfordert keine exogenen Markierungen und ist eine zerstörungsfreie Methode mit subzellulärer Auflösung.
Die Autofluoreszenzmikroskopie kann an lebenden Proben und für Zeitkursstudien verwendet werden. Die autofluoreszierende Bildgebung kann weitgehend auf alle lebenden Zellen oder Gewebe angewendet werden. Autofluoreszierende Bildgebung wurde bei Neuronen-, Krebszell-, Tumor-, In-vivo-, Stammzell- und Immunzellen eingesetzt.
Linghao Hu, ein Doktorand des Quantitative Optical Imaging Laboratory an der Texas A & M University, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie alle Komponenten des Multiphotonen-Fluoreszenz-Lebensdauermikroskops einschalten, einschließlich der Laserquelle und der Detektoren. Schalten Sie vor der Platzierung der Proben die helle Feldlampe ein und stellen Sie sicher, dass das Licht in das Okular gelangt.
Wählen Sie dann ein Objektiv für die Zellbildgebung aus. Wenn Sie kein Luftobjektiv verwenden, tragen Sie einen Tropfen des entsprechenden Tauchmediums auf das Objektiv auf. Legen Sie die Glasbodenschale auf den Probenhalter auf dem Mikroskoptisch.
Zentrieren Sie dann die Probe mit dem Objektiv unter Verwendung der X / Y-Stufensteuerung Stellen Sie sicher, dass die Probe gesichert ist und sich während der Bildgebung nicht bewegt. Sobald Sie fertig sind, schauen Sie in das Okular und bewegen Sie das Objektiv nach oben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren. Wenn sich das Mikroskop in einem Gehäuse befindet, schließen Sie die Leuchtkastentür.
Öffnen Sie als Nächstes die Bildaufnahmesoftware und klicken Sie auf die Registerkarte Multi-Photonen-Bildgebung, um die Multi-Photonen-Bildgebungsparameter wie im Manuskript beschrieben einzustellen. Stellen Sie die Verstärkung des Detektors auf den optimalen Wert für die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung (FILM) ein. Ändern Sie dann die Verweilzeit der Laserausgabe an jedem Pixel der Probe auf den gewünschten Wert.
Für Nicotinamidadenindiphosphat-Dinukleotid oder NADPH stellen Sie den Multiphotonenlaser auf 750 Nanometer ein. Vergewissern Sie sich dann, dass die Leistungsregelung für den Laser auf Null eingestellt ist, damit die Zellen beim Öffnen des Verschlusses des Lasers nicht beschädigt werden. Stellen Sie einen Emissionsfilter auf 400 bis 500 Nanometer ein.
Wenn die Parameter eingestellt sind, beginnen Sie mit der Fokussierung oder Live-Ansicht, um die Bildeinstellungen zu optimieren. Erhöhen Sie die Laserleistung langsam von drei auf acht Milliwatt und stellen Sie sicher, dass die Zellen im Fokus sind. Zeichnen Sie nach der Anpassung die maximal verbrauchte Leistung auf.
Verwenden Sie die aufgezeichnete maximale Leistungseinstellung für die Bildgebung auf anderen Segmenten der Petrischale. Sammeln Sie ein NADPH-FILM-Bild mit einer Bildintegrationszeit von 60 Sekunden und überprüfen Sie, ob das Bild eine ausreichende Anzahl von Photonen aufweist, z. B. einen Peak von 100 Photonen für ein Zytoplasmapixel innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve. Wenn die Anzahl der Photonen zu gering ist, erhöhen Sie die Laserleistung oder die Dauer der Bildaufnahme.
Stellen Sie für die Flavin-Adenin-Dinukleotid- oder FAD-Bildgebung den Multiphotonenlaser auf 890 Nanometer ein und warten Sie, bis der Laser bei der neuen Wellenlänge im Modus blockiert ist. Stellen Sie sicher, dass die Leistungsregelung für den Laser zunächst auf Null eingestellt ist. Stellen Sie einen Emissionsfilter auf 500 bis 600 Nanometer ein.
Um die Bildeinstellungen zu optimieren, beginnen Sie mit der Fokussierung oder Live-Ansicht, indem Sie die Laserleistung auf 5 bis 10 Milliwatt erhöhen und die maximal verbrauchte Leistung aufzeichnen. Verwenden Sie dieselbe Energieeinstellung für die FAD-Bildgebung nachfolgender Sichtfelder. Sammeln Sie das FAD-FILM-Bild mit einer Bildintegrationszeit von 60 Sekunden und überprüfen Sie, ob das Bild genügend Photonen innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve aufweist.
Wenn die Anzahl der Photonen zu niedrig ist, erhöhen Sie die Laserleistung oder die Dauer der Bildaufnahme und wiederholen Sie die Bildgebung für weitere vier bis fünf Sichtfelder oder FOVs, wobei jedes Bild zwei FOVs entfernt ist. Um eine 80-Millimolare Natriumcyanidlösung herzustellen, lösen Sie 130,24 Milligramm Natriumcyanid in 25 Milliliter PBS auf. Aus der Kulturschale 100 Mikroliter Kulturmedium aspirieren, um sie durch 100 Mikroliter Natriumcyanidlösung zu ersetzen, um eine vier-millimolare Konzentration von Cyanid in der Schale zu erhalten.
Legen Sie die Zellen fünf Minuten lang in einen Inkubator, damit die Zellen mit der Cyanidlösung reagieren können. Erfassen Sie nach der Cyanid-Exposition NADPH- und FAD-Bilder der Zellen wie zuvor beschrieben. Die Studie berechnete die Parameter der Fluoreszenzlebensdauer unter Verwendung der gemessenen Instrumentenreaktionsfunktion (IRF) von Harnstoff.
Die Parameter wurden über die Pixel des Zytoplasmas jeder Zelle gemittelt, die für die Segmentierung verwendet wurde. Einzelne Zellen wurden identifiziert und maskiert, um Hintergrundgeräusche zu eliminieren. Dann wurde der Zellkern identifiziert und auf die Zellmaske projiziert.
Darüber hinaus wurden die Zellen gefiltert, um die maskierten Bereiche zu entfernen, die nicht zur Größe typischer Zellen passen. Die Multiphotonen-Fluoreszenz-Lebensdauerbildgebung von NADPH und FAD ermöglichte die Visualisierung der Zellmorphologie und des Stoffwechsels vor und nach der Cyanidbehandlung. Es wurde beobachtet, dass die NADPH-Lebensdauer mit der Cyanidbehandlung abnimmt, während die FAD-Lebensdauer nach der Cyanidbehandlung zunimmt.
Das repräsentative Box-Diagramm zeigte, dass das optische Redoxverhältnis von MCF7-Zellen nach der Cyanidbehandlung abnahm. Die Cyanid-Exposition verringerte die amplitudengewichtete NADPH-Lebensdauer von MCF7-Zellen. Die kurzen und langen Lebensdauern nahmen für NADPH ab, stiegen aber für NADPH alpha eins an.
Für FAD nahm die amplitudengewichtete Lebensdauer von MCF7-Zellen nach Cyanid-Exposition zu. Sowohl die kurze als auch die lange Lebensdauer nahmen für FAD zu, nahmen aber für FAD alpha eins ab. Es ist wichtig, genügend Laserleistung für die Proben zu haben, aber denken Sie daran, dass zu viel Leistung die Zellen schädigen kann.
Da die Autofluoreszenzbildgebung die Zellen nicht schädigt, können nachfolgende biochemische Assays an denselben Proben verwendet werden.
