Rhabdomyosarkom ist eine seltene Form von Weichteilsarkomen, die histologisch durch Gewebemorphologie und die Expression myogener Marker gekennzeichnet sind. Angesichts der Existenz verschiedener Subtypen dieser Tumoren und der Heterogenität der Reize, die zu ihrer Entstehung beitragen, war die Identifizierung der Ursprungszelle jedoch eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir reproduzierbare und zuverlässige Methoden zur Identifizierung der Ursprungszelle von Rhabdomyosarkomen ausgehend von frisch geernteten Tumorgeweben von Mäusen und dieser Test ist der Tumorsphärenbildungstest.
Die Hauptvorteile des Tumorsphärenbildungs-Assays ist, dass er auf zellulären Eigenschaften beruht, von denen bekannt ist, dass sie in Tumorursprungszellen vorhanden sind, und es kann auch für die Expansion und Anreicherung der spezifischen Zellpopulation verwendet werden. Darüber hinaus imitiert seine Sphäroidstruktur die Tumorumgebung, so dass sie als Arzneimittel-Screening-Studien verwendet werden können. Diese Methode hat das Potenzial, auf andere Arten von Tumoren angewendet werden, weil es keine Vorkenntnisse der molekularen Marker erfordert, aber es kann eine Optimierung der Kulturbedingungen erfordern.
Tumorsphäre kann einige Zeit dauern, um sich zu bilden, vor allem, wenn sie versuchen, eine seltene Zellpopulation in Ihrem Tumor zu identifizieren. Daher wird nicht vorgeschlagen, Ihre Subkulturplatte jeden Tag zu betrachten, da sie sich negativ auf die Ergebnisse Ihrer Experimente auswirken könnte. Beginnen Sie mit dem Aufwärmen einer 10-Zentimeter-Platte mit fünf Milliliter Isolationsmedien in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Wiegen Sie 500 bis 1.000 Milligramm des Tumorgewebes und legen Sie es in die Platte. Bringen Sie die Platte mit dem Tumorgewebe zu einer sterilen Kulturhaube und zerkleinern Sie sie mit einer Rasierklinge. Für eine optimale Verdauung stellen Sie sicher, dass die Größen der Hackstücke einheitlich sind.
Übertragen Sie das Hackfleisch- und Zellisolationsmedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr. Waschen Sie die Platte mit weiteren vier Milliliter Medien und fügen Sie diese in die Röhre. Fügen Sie 700 Einheiten pro Milliliter Kollagenase-Lösung in das Rohr und inkubieren Sie es in einem schüttelnden Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 1 1/2 Stunden.
Nach der Inkubation das Gewebe bei 300 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur abdrehen. Den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören, dann das Pellet in 10 Millilitern zweiter Verdauungslösung wieder aufhängen und im schütteren den Wasserbad noch 30 Minuten brüten lassen. Nach der zweiten Verdauung die Zellsuspension nach oben und unten pipetteundieren und durch einen 70-Mikrometer-Nylonfilter auf einem 50-Milliliter-Zentrifugenrohr passieren.
Dann waschen Sie den Filter mit 10 Milliliterzellisolationsmedien und drehen Sie das Gewebe bei 300 mal g für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 20 Milliliter Tumorzellmedien wieder auf. Übertragen Sie die Suspension auf eine 15-Zentimeter-Kulturplatte und legen Sie die Zellen über Nacht in einen 37 Grad Celsius Inkubator.
Ändern Sie am nächsten Tag die Medien, um Trümmer und abgestorbene Zellen zu entfernen, die das Zellüberleben negativ beeinflussen können. Bewerten Sie an dieser Stelle die Zellkonfluenz und lassen Sie die Zellen im Inkubator wachsen, bis sie 90 % erreichen, um die Zellen jeden Tag zu überwachen und die Medien alle zwei Tage zu wechseln. Verwenden Sie für die Tumorsphärenableitung Zellen an Passage P1 oder P2, um die Zellauswahl durch mehrere Passagen zu vermeiden.
Waschen Sie die Zellschale mit PBS und bedecken Sie sie dann mit Ablösungslösung. Legen Sie sie fünf bis zehn Minuten in den Inkubator und bestätigen Sie dann die Ablösung, indem Sie die Platte unter einem Hellfeldmikroskop betrachten. Sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie der Platte Tumorzellmedien hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenrohr.
Drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 300 mal g nach unten, entfernen Sie Überstand und suspendieren Sie die Zellen in Tumorsphärenmedien. Nach dem Erneuten Aussetzen der Zellen, zählen Sie sie mit Trypan blau und berechnen Sie die Zellkonzentration. Die richtige Anzahl von Zellen in einer 96-well Low-Attachment-Platte zu verfestigen und die Zellen bis zum Ende des Experiments in den Inkubator legen, wobei darauf geachtet wird, die Platte nicht zu stören, es sei denn, die Medien werden wieder aufgefüllt.
Identifizieren Sie nach Abschluss des Experiments Tumorsphären manuell unter einem Hellfeldmikroskop oder mit der Celigo-Software. Die Anzahl und Größe der Tumorsphären kann als Ergebnis dieses Assays ausgewertet werden. Um Tumorsphären für eine Allograft-Transplantation vorzubereiten, ziehen Sie alle Tumorsphären zusammen, die aus einem bestimmten Zelltyp oder einer bestimmten Behandlung gewonnen werden.
Zentrifugieren Sie die Tumorsphären und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Ein-Millimeter-Pipette, gefolgt von einer 200-Mikroliter-Pipette, und waschen Sie sie dann mit 10 Millilitersterilen PBS. Drehen Sie die Tumorsphären wieder nach unten und aspirieren Sie das PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter zu einem Milliliter Zellablösung auf dem Tumorsphärenpellet hinzu und bebrüten die Zellen in einem schüttelenden Wasserbad bei 37 Grad Celsius.
Überprüfen Sie den Verlauf der Verdauung alle 10 Minuten. Der gesamte Prozess vorgangsbereit und dauert bis zu 30 Minuten. Wenn die Verdauung der Tumorsphäre im schüttenden Wasserbad nicht ausreicht, um eine einzellige Lösung zu erhalten, wird eine mechanische Störung durch Pipettieren nach oben und unten vorgeschlagen.
Beachten Sie, dass nach dem Spinnen die Tumorsphären kein stabiles Pellet bilden, daher sollte die Ansaugung des Überstandes sorgfältig mit einer Ein-Milliliter-Pipette und 200-Mikroliter-Pipetten erfolgen. Sobald eine einzellige Lösung erhalten ist, fügen Sie ein Volumen von Tumorzellmedien hinzu und drehen Sie es bei 300 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius nach unten. Nach dieser Zentrifugation müssen alle nachfolgenden Schritte auf Eis durchgeführt werden.
Setzen Sie die Zellen in kalten Tumorzellenmedien wieder aus und zählen Sie lebende Zellen mit Trypan-Blauausschluss. Bestimmen Sie die richtige Anzahl von Zellen für das Allograft und verdünnen Sie es in 50 Mikroliter kalter Tumorzellenmedien. Legen Sie eine Pipettenspitze in kalte Tumorzellenmedien, um sie zu kühlen und verwenden Sie sie dann, um 50 Mikroliter kalte ECM-Lösung zu nehmen und fügen Sie sie mit Zellen in das Rohr, wobei Sie sicherstellen, dass das ECM-Rohr während dieses Prozesses nicht vom Eis entfernt wird.
Bewahren Sie die Zellen bis zur Transplantation auf Eis und legen Sie eine gedeckelte 0,5-Milliliter-Insulinspritze mit einer 29-Spur-Nadel auf Eis. Nach der Bestätigung, dass die Maus richtig anästhesisiert wurde, rasieren Sie die rechte Seite des Tieres, aspirieren Sie die Zelllösung in die gekühlte Spritze und injizieren Sie die Zellen subkutan in den rasierten Bereich. Wenn die Injektion korrekt durchgeführt wird, bildet sich unter der Haut eine sichtbare Beule.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zuverlässig Tumorsphären zur Identifizierung seltener Zellpopulationen zu bilden, die für die Entwicklung von Weichgewebesarkomen verantwortlich sind. Ein wesentlicher Teil dieses Assays ist die Diskriminierung zwischen Tumorsphären und Zellclustern, die deutliche morphologische Unterschiede aufweisen. Um die optimale Konzentration zu bestimmen, bei der ein Protein von Interesse eine Wirkung auf Tumorzellen auslöst, ist es notwendig, den Grad der Expression der nachgelagerten Ziele des Proteins zu bewerten.
Drei der getesteten Gene zeigten eine dosisabhängige Reaktion auf die rekombinante Proteinbehandlung, und eines nicht. Um ein effizientes Protokoll zu etablieren, wurden die Auswirkungen der Transfektion auf inhärente Tumorzellen analysiert;zwei verschiedene Mengen an Reagenz wurden getestet und die Effizienz mit einem GFP-Reporter-Plasmid bewertet. Geringere Reagenzmengen führten zu einer höheren Transfektionseffizienz.
Ein zweistufiges Protokoll musste implementiert werden, um die Transfektion von Zellen in Suspension durchzuführen. Transfektion wurde an an haftenden Zellen durchgeführt und 24 Stunden später wurden sie abgelöst und in Suspension plattiert; nach sieben Tagen drückten kontrollierte Tumorsphären GFP aus. Nach der Erzielung, Behandlung und Transplantation von Tumorsphären ist es möglich, die Wirkung dieser unterschiedlichen Behandlung beim Tumorwachstum in vivo zu vergleichen.
Diese Methoden werden es den Wissenschaftlern ermöglichen, die noch immer stehenden Fragen der Herkunftszelle von Rhabdomyosarkomen zu beantworten und gleichzeitig die Grundlage für das Drogenscreening zu legen.
