Die Speicherstabilität von extrazellulären Vesikeln ist ein wichtiger Parameter für ihre prospektive therapeutische Anwendung. Unser Protokoll bietet ein leicht anwendbares Werkzeug zur Bewertung der Auswirkungen der Lagerung auf die Vesikel. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass durch die Einführung von Glucuronidas e als exogener Marker, extrazellulären Vesikeln, die von verschiedenen Elternzellen abgeleitet werden, leicht in Bezug auf ihre Storierbarkeit verglichen werden kann.
Asymmetrische Strömungsfeldflussfraktionierung, oder AF4, ist eine milde Alternative zur Größenausschlusschromatographie-Reinigung für sehr empfindliche Verbindungen. Denn die Verbindungen stoßen im Kanal auf weniger Stress. Da Glucuronidase ein empfindliches Enzym ist, profitiert die Qualität der residierenden von einer gründlichen Planung und Durchführung der Schritte zur Reinigung und Analyse von hinten nach hinten.
Nach der Kultivierung der Zelllinie von Interesse unter den Standardbedingungen für diese Zellen, ersetzen Sie den Überstand mit Serum frei oder extra zellulären Vesikel erschöpft Medium und die Zelle in den Zellkultur-Inkubator für weitere 24 bis 72 Stunden zurück. Am Ende der Inkubation, sammeln Sie den Supernatant aus jedem Kolben und Zentrifugieren sie die Proben, um die Zellen zu sedimentieren. Sammeln Sie das zellkonditionierte Medium sorgfältig, ohne das Pellet zu stören.
Und zentrifugieren Sie das Medium wieder, um Zellablagerungen und große Aggregate zu entfernen. Dann die Überräube vorsichtig in Ultrazentrifugenrohre übertragen. Wenn Sie einen festen Winkelrotor verwenden, markieren Sie die Ausrichtung der Rohre in der Zentrifuge, um das Abrufen des extrazellulären Vesikelpellets nach der Zentrifugation zu erleichtern.
Verwenden Sie am Ende der Ultrazentrifugation eine serologische Pipette, um den Überstand sorgfältig zu entsorgen, ohne das extrazelluläre Vesikelpellet zu stören. Bei 200 Mikrolitern 0,2 Mikrometer Poren gefiltertpbS zum Restüberstand des ersten Ultrazentrifugenrohrs. Nach dem Wiederaufsetzen des Pellets die resultierende extrazelluläre Vesikelsuspension zur Wiederaufhängung des nachfolgenden Pellets in das nächste Rohr übertragen, bis alle extrazellulären Vesikelpellets wieder ausgesetzt sind.
Fügen Sie der endgültigen resuspendierten Pelletlösung Beta-Glucuronidase zu einer Endkonzentration von 1,5 Milligramm pro Milliliter hinzu. Und Saponin auf eine Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter. Dann gut mischen, indem Sie für drei Sekunden wirbeln und legen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit intermittierenden sanften Flicken.
Sobald die Glucuronidase gekapselt wurde, achten Sie darauf, alle nachfolgenden Reinigungsvesikle-Evaluierungsschritte am selben Tag durchzuführen, um unvoreingenommene Ergebnisse der Speicherstabilität zu erhalten. Lassen Sie eine Größenausschlusschromatographie-Säule mit mindestens zwei Säulenvolumina von PBS gleichsetzen, die bereit sind, das Pellet unmittelbar nach der Saponin-Inkubation zu reinigen. Um zu reinigen, addieren Sie bis zu 400 Mikroliter extrazelluläre Vesikelsuspension auf die Säule.
Dann sammeln Sie einen Milliliter Bruchteil des Eluats. Um die Trennung der extrazellulären Vesikel von den kontaminierenden Proteinen und der freien Glucuronidase zu entsprechen, messen Sie die Proteinkonzentration durch Bicinchoninsäure-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie für den jeweiligen Instrumenten- und Vesikeltyp optimierte Parameter, um die größe und Konzentration der extrazellulären Vesikel zu messen.
Um die Glucuronidase-Aktivität zu messen, fügen Sie 25 Mikroliter frisch zubereitetes Fluorescin-Di-Beta-D-Glucuronid zu 125 Mikrolitern der gereinigten extrazellulären Vesikel hinzu und fügen Sie die Probe zu einem Brunnen einer schwarzen 96-Well-Platte hinzu. Messen Sie die Zeit null Fluoreszenproduktion auf einem Plattenleser bei einer Anregung von 480 Nanometern und einer Emission von 516 Nanometern. Bedecken Sie die Platte fest mit transparenter Kunststofffolie, um die Verdunstung zu reduzieren.
Dann inkubieren Sie die Platte vor Licht für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius geschützt. Messen Sie die 18-Stunden-Fluoreszenproduktion am Plattenleser, wie gerade gezeigt. Für die extrazelluläre Vesikellyophilisierung, fügen Sie vier Milligramm pro Milliliter Trehalose zu den gereinigten Vesikel.
Und frieren die Vesikel bei minus 80 Grad Celsius für mindestens eine Stunde ein. Um die Proben lyophilisieren, stellen Sie die Regaltemperatur eines Lyophilisators auf 15 Grad Celsius und den Druck auf 0,180 Millibar. Trocknen Sie die Vesikel unter diesen Bedingungen für 46 Stunden.
Am Ende des Haupttrocknungsschritts die Regaltemperatur auf 25 Grad Celsius und den Druck auf 0035 Millibar einstellen und die Proben unter diesen Bedingungen zwei Stunden trocknen. Dann lagern Sie die lyophilisierten Proben bei vier Grad Celsius. Um die Proben nach der Lagerung zu rehydrieren, fügen Sie vor der Lyophilisierung ein Wasservolumen hinzu, das dem Volumen der extrazellulären Vesikelsuspension entspricht.
Um die Enzymaktivität nach der Lagerung zu bewerten, laden Sie ein AF4-Instrument mit frisch vorbereiteten 0,1 Mikrometer gefilterten PBS für die mobile Phase und legen Sie eine 0,1 Mikrometer Filtermembran in den Spitzeneinlassfilter nach der Pumpe ein, um partikelgemausen des Lösungsmittels zu reduzieren. Nach der Demontage den kleinen Kanal für AF4 mit MillEq-Wasser reinigen. Hydratisieren Sie eine neue regenerierte Zellulosemembran mit einem Von3 Kilodaltons abgeschnittenen Molekulargewicht und legen Sie die Membran mit der glänzenden Seite nach oben auf den Bund.
Platzieren Sie einen breiten 350-Mikrometer-Abstandsraum unter der oberen Hälfte des Kanals und montieren Sie die Kanalteile. Mit einem Drehmomentschrauber die Schrauben zunächst auf ein Drehmoment von fünf Newtonmetern, dann auf ein Drehmoment von sieben Newtonmetern festziehen. Anziehen der Schrauben um den Block in einem Kreuzmuster.
Verbinden Sie die Kanäle Einlass-, Auslass- und Querstromanschluss mit der Sonnenfinsternis. Dann aus mindestens drei alten Proben, um die Membran auszuausgleichen. Programmieren Sie einen Fraktionierungslauf mit einem Konzentrations- und Fokusstrom von einem Milliliter pro Minute und einem Injektionsfluss von 0,2 Milliliter pro Minute.
Nach einem einminütigen Vorfokusschritt injizieren Sie die Probe über einen Zeitraum von 10 Minuten in den Fokus und injizieren Sie schritt, bevor Sie den Querfluss von zwei Milliliterpro Minute auf 0,1 Milliliter pro Minute im Laufe von acht Minuten verringern. Beenden Sie den Fraktionierungslauf mit einem Elutionsschritt ohne Querfluss für 10 Minuten und fügen Sie einen Waschschritt der Elution und Injektion hinzu, gefolgt von einer Elution. Dann den Kanal für den nächsten Lauf mit einem anfänglichen Querfluss von zwei Millilitern pro Minute ausdematrieren und den UV-Detektor auf 280 Nanometer einstellen.
Wenn alle Programme eingestellt sind, injizieren Sie 300 Mikroliter der Probe und zeichnen Sie die UV- und Lichtstreuungssignale in der ASTRA-Software auf. Nach 12einhalb Minuten, beginnen Sie das Sammeln von einem Milliliter Fraktionen bis 27 Minuten nach der Injektion. Führen Sie dann einen Glucuronidase-Assay und eine Nanopartikel-Tracking-Analyse durch, wie gezeigt.
Hier werden die Partikelrückgewinnung und die Größe der extrazellulären Vesikel, die nach sieben Tagen Lagerung unter verschiedenen Bedingungen aus menschlichen vaskulären Endothelzellen isoliert sind, im Vergleich zu einer frischen Probe dargestellt. Vesikel wurden anschließend der AF4-Reinigung unterzogen und die Glucuronidase-Aktivität pro Partikel gemessen. Sowohl die Größenausschlusschromatographie als auch AF4 sind erfolgreich bei der Trennung von extrazellulärer Vesikel von freier Glucuronidase.
Aufgrund des höheren Trennungsgrades für AF4 zwischen Partikeln und freiem Enzym ist eine Kontamination der vesikelhaltigen Fraktionen weniger wahrscheinlich. Die AF4-Reinigung nach der Lagerung entfernt freies Enzym aus den Proben und senkt so die Menge der wiedergewonnenen Enzymaktivität pro Partikel. Dieser Effekt ist am deutlichsten nach der Lagerung bei vier Grad Celsius, für die eine 2/3 Reduktion beobachtet wird.
Das Weglassen dieses zusätzlichen Reinigungsschritts kann zu falschen Annahmen über die Enzymstabilität führen. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigt keine großen Formunterschiede bei extrazellulären Vesikeln, die ohne Kryoprotektor lyophilisiert werden. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt jedoch das Vorhandensein von Aggregaten in den lyophilisierten Proben, die in den gespeicherten Proben von minus 80 Grad nicht gefunden werden.
Es ist entscheidend, dass freies Enzym aus den Vesikeln vor dem Glucuronidase-Test entfernt wird. Daher muss die Technik der Vesikelreinigung gründlich evaluiert werden. Die gereinigten Partikel konnten auch in Bezug auf ihre Oberflächenladung betrachtet werden, um herauszufinden, ob die Lagerung die natürliche Zusammensetzung der Membranproteine oder Zucker verändert.
Mit unserer Technik ist es möglich, eine erste Anzeige über die extrazelluläre Vesikelspeicherstabilität zu erhalten, auch wenn keine bekannten spezifischen Marker oder Assays für die Aktivität verfügbar sind.
