Die ELISA-Technik ist sehr nützlich für den Nachweis von Malariaparasiten im Mückenvektor mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität und in der Lage, viele Proben gleichzeitig zu verarbeiten. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Mückenproben aufzubewahren, bis sie für die Probenverarbeitung bereit sind, und sie kann zur Unterscheidung von Plasmodium-Spezies mit speziesspezifischen monoklonalen Antikörpern durchgeführt werden. Bereiten Sie die Probe vor, indem Sie den Kopf und den Thorax der Mücken vom Bauch trennen und sie in ein vorbeschriftetes 1,5-Milliliter-Zentrifugenmahlröhrchen geben.
Geben Sie 50 Mikroliter Mahlpuffer in jedes Röhrchen und homogenisieren Sie die Probe mit einem Stößel. Spülen Sie den Stößel mit 250 Mikrolitern Mahlpuffer ab und geben Sie die Lösung in das Röhrchen, um das endgültige Volumen auf 300 Mikroliter zu bringen. Bereiten Sie eine ELISA-Platte für das Zirkumsporozoitenprotein vor und füllen Sie das Sporozoit-ELISA-Arbeitsblatt aus.
Bereiten Sie die Antikörperlösung in PBS vor und fügen Sie fünf Milliliter der Lösung pro Platte hinzu. Pipettieren Sie 50 Mikroliter der Antikörperlösung in jede Vertiefung der ELISA-Platte. Legen Sie einen Deckel auf die Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten oder über Nacht bei Raumtemperatur.
Aspiriere die Lösung in der Vertiefung und klopfe fünfmal auf die Platte auf ein Papiertuch, um die Flüssigkeit zu entfernen. Geben Sie 200 Mikroliter Blockierungspuffer in die Well-Platten und decken Sie sie mit einem Deckel ab. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren und den Inhalt der Vertiefung ansaugen.
Klopfen Sie erneut auf den Teller auf ein Papiertuch, um die Flüssigkeit zu entfernen. Geben Sie 50 Mikroliter Positivkontrolle in die Vertiefungen H eins und H zwei. Geben Sie dann 50 Mikroliter Blockierungspuffer in die Vertiefungen in den Spalten eins und zwei der Zeilen C bis G.Geben Sie 50 Mikroliter der Positivkontrolle in die Vertiefungen G eins und G zwei.
Die Positivkontrolle beginnend mit G eins und G zwei wird nacheinander verdünnt, gefolgt von F eins und F zwei bis C eins und C zwei. 50 Mikroliter der Negativkontrolle werden in die Vertiefungen A eins, A zwei, B eins und B zwei gegeben. Extrahieren Sie 50 Mikroliter der Homogenatlösung und geben Sie sie in eine unbekannte Vertiefung.
Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Substratlösung vor, indem Sie Substrat A und B im Verhältnis eins zu eins mischen. Bestimmen Sie das erforderliche Volumen durch Zugabe von fünf Millilitern konjugierter Antikörperlösung zu jeder Platte.
Bewerten Sie die Peroxidaseaktivität, indem Sie fünf Mikroliter der mit Peroxidase markierten Antikörperlösung zu 100 Mikrolitern der Substratlösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. Saugen Sie den Inhalt der Vertiefung ab und entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie die Platte kopfüber auf ein Papiertuch legen. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS Tween.
Saugen Sie den Inhalt der Vertiefung ab und klopfen Sie fünfmal auf die Platte. Geben Sie 50 Mikroliter Peroxidase-markierte Antikörperlösung in jede Vertiefung. Dann im Dunkeln eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.
Saugen Sie den Inhalt der Vertiefung ab und klopfen Sie fünfmal auf die Platte auf ein Papiertuch. Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS Tween, saugen Sie den Inhalt an und klopfen Sie fünfmal auf die Platte. Geben Sie 100 Mikroliter der Substratlösung in jede Vertiefung.
Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation wird die Absorption bei 405 bis 414 Nanometern mit einem ELISA-Platten-Reader abgelesen. Kennzeichnen Sie die Proben mit einer Extinktion mit einem Wert über dem Cutoff als positiv und bestimmen Sie die CSP-Konzentration in der Probe anhand des Standards.
Plotten Sie die Absorptionswerte im Vergleich zur Lösungskonzentration auf, um eine Standardkurve zu erstellen. Bestimmen Sie die beste Anpassung mit der linearen Regressionsmethode. Lösen Sie die Gleichung der einzelnen Absorptionswerte für eine positive Probe, um die CSP-Konzentration zu bestimmen.
Nach 30 Minuten ELISA-Durchführung mit ABTS konnte eine Sporozoiteninfektion durch das Auftreten einer schwachen grünen Farbe in der Vertiefung nachgewiesen werden. Die Positivkontrolle zeigte keine Farbveränderung in der Vertiefung. Es wurden die Absorptionswerte für die negative und die positive Vertiefung bestimmt.
Die positive Vertiefung wies einen Absorptionswert auf, der über der Cutoff-Schwelle lag, während die Negativkontrollen signifikant niedrigere Werte aufwiesen. Darüber hinaus wurden auch die Absorptionswerte der anderen 80 unbekannten Bohrungen ermittelt. Die durchgezogene Linie stellt die mittlere Absorption der negativen Kontrollvertiefungen dar, und die gestrichelte Linie stellt die Positivitätsschwelle dar.
Unter Verwendung der Standardkurve wurde die CSP-Konzentration in Vertiefung A sieben auf 0,35 Pikogramm pro Mikroliter bestimmt. Dieser Schritt der ELISA-Verarbeitung sollte schnell durchgeführt werden, um unspezifische Vektoren zu vermeiden. Darüber hinaus sollten alle Proben und die Lösung im Kühlschrank aufbewahrt werden, um das mikrobielle Wachstum zu verhindern. Den Forschern wird empfohlen, die positiven Nachweise durch andere Methoden wie PCR zu bestätigen.
Dies wird die Zuverlässigkeit erheblich verbessern, insbesondere wenn der einzige Messwert über dem Schwellenwert liegt. Diese Technik hat es den Forschern ermöglicht, in größerem Maßstab Erhebungen über mögliche Infektionen in den Mücken durchzuführen, was für die Identifizierung des Hauptvektors wichtig ist.
