Dieses mikrofluidische Krebs-On-Chip-Modell, das wir Evolutionsbeschleuniger nennen, bietet eine kontrollierbare Plattform für langfristige, echtzeit-quantitative Studien zur Krebsdynamik innerhalb klar definierter Umweltbedingungen auf einer einzelnen Zellebene. Die Technologie ermöglicht es uns, die evolutionäre Dynamik von Krebs unter einer tumorartigen Stresslandschaft zu erforschen. Bereitstellung von Informationen wie Morphologie, Population, Beweglichkeit und Migration im Laufe der Zeit auf zellulärer Ebene.
Mit der Fähigkeit, das Verhalten gemischter Tumorpopulationen unter gut kontrollierten Spannungsgradienten zu kontrollieren und zu überwachen, kann unsere Technologie ein physiologisch relevanteres Modell für die präklinische Arzneimittelentwicklung darstellen. Das vorgestellte Druckversiegelungsverpackungsverfahren kann auch in anderen mikrofluidischen Systemen eingesetzt werden, die eine ausgeklügelte Anpassung der Umgebungsgaszusammensetzung sowie der nachgelagerten Versuchskapazität erfordern. Der Schlüssel, um ein Langzeitexperiment erfolgreich durchzuführen, ist die Sicherung einer physikalisch und biochemisch stabilen Umgebung.
Faktoren wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Gaszusammensetzung sollten jederzeit überwacht werden. Zu Beginn einen Tellerhalter fertigen, der ausreicht, um gleichzeitig gasdurchlässige Kulturgerichte auf einer 3D-Druckmaschine zu halten. Lösen Sie die Komponenten der kundenspezifischen drei Bohrbleche mit Schraubenzieher.
Desinfizieren Sie die Komponenten mindestens eine Stunde lang über UV-Belastung und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung. Um mit der Zelllinienaussaat zu beginnen, fügen Sie fünf Milliliter Trypsin in jede PC3-Epi- oder PC3-EMT-Zellkultur in einer 10-Zentimeter-Kulturschale hinzu und führen Sie die Trypsinisierung fünf Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius aus. Die Zellen aus den Kulturgerichten in 15 Milliliter Zentrifugenröhren und dann zentrifugieren bei 150 mal g für drei Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie jedes der Zellpellets in den 15 Milliliter Zentrifugenröhren wieder auf und zählen Sie die Zellen jedes PC3-MP oder PC3-EMT mit einem Hämozytometer. Isolieren Sie insgesamt 2,5-mal 10 bis zu den vier einzelnen Zelltypen.
Mischen Sie die beiden isolierten Zelltypen und fügen Sie zwei Milliliter Kulturmedien hinzu. Säen Sie zwei Milliliter der Zellkultur in jedes der drei gasdurchlässigen Kulturgerichte. Lassen Sie das Gas im Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht für die Zellen zu befestigen.
Desinfizieren Sie die PDMS-Geräte mindestens eine Stunde lang über UV-Belastung und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung. Jetzt ein Gasversorgungssystem einrichten, das sowohl aus Kohlendioxid- und Sauerstoffsteuergeräten, einer Gaspumpe, einer Gasmischkammer, einem Luftbefeuchter oder Blasen, und drei separaten Sätzen von Gasventilen und Manometern besteht. Alternativ können Sie ein Gasversorgungssystem verwenden, das Normoxia-Zustand bietet.
Stellen Sie sicher, dass die relative Luftfeuchtigkeit in der Mischkammer auf über 85% erhöht wird, richten Sie eine thermische Steuerung auf der Bühne bei 37 Grad Celsius mit separaten Heizuntereinheiten für den Deckel und die Bodenplatte ein. Am nächsten Tag nehmen Sie die gasdurchlässigen Kulturgerichte aus dem Inkubator und erkennen, dass die detaillierten Komponenten in Ordnung sind, Jeder Brunnen besitzt einen gasdurchlässigen Kulturschalenhalter, einen PDMS-Chiphalter, einen Glasfensterhalter und ein Paar 35 Milliliter breite Glasfenster. Verwenden Sie die montierten Schrauben, um diese Komponenten zu montieren und die gasdurchlässige Kulturschale zu klemmen.
Dann das vorgewärmte Kulturmedium für 20 Minuten in eine Vakuumkammer auf Degas übertragen. Behandeln Sie den PDMS-Chip 30 Sekunden lang in einem Sauerstoffplasmasystem, um die Hydrophilie aufrechtzuerhalten. Als nächstes zwei Spritzen langsam mit 10 Milliliterentgasungs-Wachstumsmedien und die anderen beiden Spritzen mit 10 Millilitern entgastem erwünschtem Reagenz beladen.
Zum Beispiel Medien und Medien mit Drogen. Verbinden Sie jede einzelne Spritze mit einem 50-Zentimeter-Schlauch durch eine 23-Grad-Dosiernadel in einen Hohlstahlstift. Setzen Sie einen hohlen Stahlstift in das andere Ende des Schlauches ein.
Schieben Sie das Medium in die Schläuche, um den Schlauch zu grundieren, und stecken Sie den Stahlstift durch die Verschlussschicht in jeden PDMS-Chip. Füllen Sie die Reservoirschicht und befeuchten Sie die PDMS-Musterschicht mit Medien. Die Reservoirschicht funktioniert als On-Chip-Blasenfalle, um zu verhindern, dass Luftblasen in das mikrofluidische Muster gelangen.
Dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit Kulturmedien beladen. Schließen Sie die Spritze mit einer 23-Meter-Dosiernadel an einen Fünf-Zentimeter-Schlauch an. Legen Sie einen hohlen Stahlstift in das andere Ende des Schlauches und grundieren Sie die Schläuche.
Setzen Sie den Hohlstahlstift in das mittlere Loch des Chips ein, damit später übermäßige Medien extrahiert werden können. Legen Sie zwei 10-Milliliter-Spritzen pro Chip in das Vorderdeck und legen Sie die beiden anderen Spritzen in das Entnahmedeck des Spritzensystems. Um mikrofluidische Mikroblasen im mikrofluidischen Muster zu vermeiden, geben Sie einen Milliliter des vorgewärmten und entgaseten Mediums in das 35 Milliliter tiefe gasdurchlässige Kulturgericht aus.
Positionieren Sie die Späne direkt auf den gasdurchlässigen Kulturmembranen, wo sich der Chip mit einem Neigungswinkel von 15 Grad der flüssigen Oberfläche nähert. Klemmen Sie den PDMS-Chip mit dem PDMS-Chiphalter und drücken Sie das PDMS-Gerät nach unten. Kleben Sie eine Dichtungsplatte auf die Oberseite des PDMS-Geräts und klemmen Sie mit PDMS-Chiphalter, um ein Austrocknen des Chips zu verhindern.
Legen Sie den Medienfluss um das Array auf 20 Mikroliter pro Stunde fest. Positionieren Sie die gesamte Platte im Inkubator auf der motorisierten Bühne eines invertierten Mikroskops. Schließen Sie das Gasversorgungssystem über Gasschläuche an die Gaskanäle an und halten Sie den Messdruck bei 0,2 PSI.
Dadurch wird die gasdurchlässige Kulturmembran gegen den installierten PDMS-Chip unter Druck gebracht, um die Abdichtung des Gerätes zu gewährleisten. Extrahieren Sie langsam übermäßige Medien im Chip mit der Ein-Milliliter-Spritze aus dem mittleren Loch. Beobachten Sie den Chip unter dem Mikroskop beim Extrahieren von Medien und beenden Sie dann das Extrahieren, wenn der Chip versiegelt ist.
Schließen Sie die Temperaturerfassungseinheit des Onstage-Inkubators an die drei Brunnenplatten an und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. In dieser Studie pc3 kultiviert in einem Evolutionsbeschleuniger ohne das Vorhandensein von äußerer Spannung hatte Wachstumskurven, während ausgerichtet. Vorschlag der Identischigkeit des Zellproliferationsprofils als Funktion der Position über den Chip.
Die anfängliche Steigung der Kurven zeigt die Proliferationsrate. Die Verdoppelungszeit für Zellen im Gerät beträgt etwa 24 Stunden. GFP-Exzess pc3-EMT und mCherry, die PC3-Epi-Zellen ausdrücken, wurden im Evolutionsbeschleuniger mitkultiviert.
Ab 40 % Zusammenfluss wuchs die Kokultur innerhalb von drei Tagen um 40 %. Während die Wachstumskurve des Gesamtzusammenflusses in Form eines logistischen Wachstumsmodells erfolgt. Die Population von PC3-EMT expandierte weiter und PC3-Epi wurde in der asymptotischen Phase unterdrückt.
PC3-Epi- und PC3-EMT-Zellen saßen dicht in der Mitte des Geräts und durften frei in den leeren Bereich migrieren. Das normalisierte Histogramm der Geschwindigkeit beider Phänotypen zeigt, dass die Geschwindigkeit von PC3-EMT um das 1,8-fache signifikant höher war als pc3-Epi. Es ist sehr wichtig, die Erstellung von Mikroblasen um jeden Preis zu vermeiden, während die Kulturmedien vorgewärmt und entgast werden sollten.
Der PDMS-Chip sollte richtig benetzt und schonend gehandhabt werden. Aufgrund der weichen Wiederversiegelung setzbar enden wir viele nachgeschaltete Experimente. Wie subklinische Populationsextraktion, lokale Metabolitenanalyse und räumlich gelöste Immunfluoreszenz und Sequenzierung.
Unsere Technologie zeigt eine Möglichkeit, wichtige Komponenten und Interaktionen in einer komplexen Super-Mikro-Umgebung umfassend zu reproduzieren. Doch einfach genug, um quantitative, zuverlässige und reproduzierbare Daten bereitzustellen.
