This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

HINWEIS: Eine Maus Erträge ausreichend Myoblasten für etwa zwei 35-mm-Schalen oder zwei Live-Imaging-Gerichte, so Plan Mattierungen, Dissektion und Beschichtung (Schritt 2.6) entsprechend. 10 Tiere - Da Myoblasten durch sequentielle Zentrifugationen und Vorabscheidungs ​​isoliert werden, sollte das Protokoll in Chargen von 5 erfolgen. Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Tierethikkommission im Instituto de Medicina Molecular und Universität Pierre et Marie Curie genehmigt 1. Dissection von neugeborenen Mäusen Hind Gliedmaßen Muskeln <ol><li> Bereiten Sie alle Lösungen im Voraus (Werkstoff - Tabelle) und sterilisieren durch Filtration (0,22 &amp; mgr; m - Filter). Sicherstellen , dass alle Medien , auf 37 ° C werden vor der Zugabe zu den Zellen, mit Ausnahme der Formulierungen Basalmembran - Matrix , die (beispielsweise Matrigel). </li><li> Sterilisieren Sie die Dissektion Material (je eine aus: gebogene Schere, gerade Schere, regelmäßige Zange,und Feinspitze Zange) und die Werkbank, indem sie mit 70% Ethanol abwischen. </li><li> Bereiten Sie eine 100 mm Petrischale mit 5 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) für das Muskel Sammlung und halten Sie sie auf Eis, bis die Zerkleinerungs- Schritt. </li><li> Enthaupten P6 - P8 Mäuse mit geraden Schere und sterilisieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Einschnitt in der Rückseite der Haut und ziehen Sie sie vorsichtig auf die Hinterbeine, bis sie entfernt wird, vollständig die Hinterschenkel-Muskulatur auszusetzen. </li><li> Verwenden Sie die Zange Fettgewebe zu entfernen, ohne die Muskeln zu beschädigen. </li><li> Um die Rückenhinterbeinmuskeln zu entfernen, halten Sie das Bein gestreckt und biegen Sie die Pfote an der Ferse Sehnen aus. Verwenden Sie die gebogene Schere zum Trennen von Muskel von Knochen, von den Sehnen beginnen, durch sanftes Gleiten und Schneiden nach oben. Excise die Muskeln und sie in gefrorener DPBS. </li><li> Isolieren Sie die Quadrizeps durch den Muskel mit Feinspitze Zange kneifen und schneiden um es ohne den Oberschenkelknochen oder das Kniegelenk zu beschädigen.</li><li> Nachdem alle Tiere seziert, gehen Sie sollten in einen sterilen Laminar-Flow-Zellkultur-Haube, wenn alle folgenden Schritte durchgeführt werden. </li></ol> 2. Myoblasten Isolation <ol><li> Entfernen Sie den Überschuss an DPBS. Mince das Gewebe mit sterilisiertem gebogene Schere, um eine einheitliche Masse zu erhalten. </li><li> Sammeln das zerkleinerte Gewebe in einer 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von 5 ml Verdauungsmischung und Inkubieren sie unter Rühren bei 37 ° C für 90 min. </li><li> Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 6 ml Dissektion Medium und Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 75 xg das verbleibende Gewebe zu pelletieren. </li><li> sammeln vorsichtig den Überstand. Achten Sie darauf, nicht Gewebedebris sammeln. Zentrifugieren es bei 350 xg für 5 min; Resuspendieren in 5 ml Dissektion Medium. </li><li> Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb. 25 ml Dissektion Medium und Vorbeschichtungszyklus sie in einem 150 - mm - Schale für 4 h in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO 2 &lt;/ Sub&gt;) die Fibroblasten zu ermöglichen, zu haften. </li><li> Während Vorplattieren mantel Gerichte mit 500 &amp; mgr; l Basalmembranmatrix 1: 100 verdünnt in kaltem IMDM für 1 h bei RT. Waschen Sie einmal mit DPBS und die Zellen Platte sofort (Schritt 2.8) oder verlassen mit Wachstumsmedium bis Plattierung. </li><li> Nach Vorplattieren, sammeln Sie den Überstand und Zentrifuge für 10 min bei 350 x g. </li><li> Resuspendieren sie in einem Wachstumsmedium und zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer. Stellen Sie die Lautstärke so, dass zwischen 150.000 und 250.000 Zellen pro Basalmembranmatrix beschichtete Schale ausgestrichen werden. Halten Sie die Zellen in einer Zellkultur-Inkubator. </li></ol> 3. myofiber Differenzierung HINWEIS: Nach 3 d, sollten die Zellen zu Sicherung und Form Myotuben bei etwa 70% Konfluenz (Abbildung 1B) beginnen. <ol><li> An diesem Punkt, um die Zellen zu transfizieren, falls gewünscht, mit einer siRNA oder DNA von Interesse. Wenn die Zellen nicht transfiziert werden, ändern Sie direkt an Differenzierungsmedium und Skip zu Schritt 3.4. </li><li> Transfizieren mit Transfektionsreagenzien den Anweisungen des Herstellers folgen. Inkubiere die Zellen für 5 h mit siRNA-Lipid-Komplexe (20 nM + 1 &amp; mgr; l Reagenz) oder DNA-Lipid-Komplexe (1 &amp; mgr; g + 1 &amp; mgr; l Reagenz). Optimieren Sie die siRNA und DNA-Konzentrationen, wenn nötig. </li><li> Waschen Sie sie einmal mit Differenzierungsmedium und wechseln Sie dann auf neue Differenzierungsmedium. </li><li> Am folgenden Tag, verdünnen Sie die Basalmembranmatrix 1: 2 in eiskaltem Differenzierungsmedium. Entfernen Sie das vorhandene Medium und mit 200 &amp; mgr; l eiskaltem Matrix zu jedem Gericht. </li><li> Inkubieren für 30 min in einem Zellkulturbrutschrank. </li><li> Ergänzen Sie die Differenzierungsmedium mit Agrin (100 ng / ml) und vorsichtig 2 ml zu den Zellen. </li><li> ändern Sie vorsichtig die Hälfte des Mediums alle 2 d, Ergänzung stets mit Agrin bis zu einer endgültigen Konzentration von 100 ng / ul. </li><li> Überwachen Sie die Zelldifferenzierung und Lebensfähigkeit. In Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren ab (wie FBS und chicken Embryo Extrakt Ursprung), könnte nehmen die Zellen zwischen 5-10 Differenzierung d vollständige Reifung (Abbildung 2) zu erreichen. </li></ol> 4. Immunostaining in Glasboden Geschirr <ol><li> Für die Immunfärbung, zu jeder Zeit-Punkt von Interesse, waschen Sie die einmal Zellen mit DPBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA bei RT für 10 min. </li><li> Waschen Sie sie zweimal mit DPBS. An diesem Punkt können die Zellen bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Permeabilisieren sie mit 0,5% Triton X-100 für 5 min bei RT. </li><li> Waschen Sie sie zweimal mit PBS und Block mit 30 min bei RT-blockierende Lösung. </li><li> Inkubieren sie mit dem primären Antikörper verdünnt in Blockierungslösung O / N bei 4 ° C. </li><li> Wasch 3x mit DPBS für 5 min bei RT. </li><li> Inkubieren sie mit dem sekundären Antikörper, und 0,2 &amp; mgr; g / ml DAPI für 1 h bei RT. </li><li> Wasch 3x mit DPBS für 5 min bei RT. </li><li> In 200 ul Eindeckmediums und fahren Sie mit Bildgebung. </li></ol>

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Electroporation,+Isolation+and+Imaging+of+Myofibers.">DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers.</a> J Vis Exp. (106), (2015).</li><li>Falcone, S., Roman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Verwendung dieses Protokolls für die Kultivierung von primären Myoblasten entsteht eine besondere Nische, die die Entwicklung von Muskelfasern stark fördert. Dies ist teilweise auf andere Zelltypen, die in sehr geringen Stückzahlen auch vorhanden sind. Ein Gleichgewicht zwischen Myoblasten Konzentration und Reinheit der Kultur erreicht werden muss. Eine gute Zellkultur hängt auch von der Qualität der Produkte für das Medium Formulierung verwendet. Alle Produkte aus tierischen Quellen stammen sollten gründlich geprüft werden. Nach unserer Erfahrung sollten die Aufschlussbedingungen überwacht werden. Wie üblich für Primärkulturen können experimentelle Variabilität höher sein als in den Studien mit isolierten Fasern oder unsterblich gemacht Myoblasten. Diese Variabilität kann durch die Standardisierung von mittleren und Verdauung Komponenten, Mäuse Alter und Größe, und die Zeitpunkte für die Manipulation der Kultur und Ergebnisse Sammlung vermindert werden. Dennoch ist der Vorteil der komplizierten Mechanismen in Echtzeit prüfendennotwendig für myofiber Entwicklung übertrifft deutlich die Variabilität Nachteil. Dieses Protokoll verleiht die Vorteile der in - vitro - Ansätze ohne Zelldifferenzierung zu beeinträchtigen. Reifen Muskelfasern bis Triaden gebildet werden und Kontraktionen Calcium Funken gekoppelt sind. Diese funktionellen Ausgänge können in verschiedenen experimentellen Bedingungen erreicht werden. Darüber hinaus kann es viele technische Variationen des Protokolls. Myoblasten können von neugeborenen Mäusen mit Mutationen von Interesse im Bereich der Muskelentwicklung geerntet werden. Die Zellen können für die biochemische Analyse an verschiedenen Differenzierungszeitpunkten aufgelöst werden. Calcium-Indikatoren können zu der Kultur hinzugefügt werden, um die Dynamik zu folgen. Optogenetische Konstrukte können verwendet werden, um bestimmte Signalwege zu erzwingen oder spezifische lokale Antworten zu induzieren. Schließlich können die Muskelfasern mit anderen Zellen kokultiviert werden Typen ihre Interaktionen zu studieren.

Skelettmuskel komponiert 1 bis 40% des menschlichen Körpergewichts. Muscle-assoziierten Erkrankungen stellen eine immense gesundheitliche und wirtschaftliche Belastung 2. Wie diese hochkomplexen und organisierte Gewebe gebildet wird, gehalten und regeneriert stellt ein umfangreiches und gut etabliertes Forschungsfeld. 6 - Abhängig von der spezifischen wissenschaftlichen Interesse, die am besten geeignete Ansatz kann von einfachen Myotubenkulturen bis hin zu komplexen in vivo - Modellen 3 reichen. Das Ziel des Protokolls ist es, ein in vitro - System zu schaffen , das für die Überwachung der Myogenese durch Echtzeit- Bildgebung und Immunofluoreszenz ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen bietet dieses System eine sehr komplette und dynamischen Einblick in die myogenen Prozess Maus. Die Zellen können aus der Myoblasten - Stufe zu der reifen, mehrkernige myofiber Anzeige transversal Triaden und peripheren Kerne 7 folgen. Diese Reifung Ebene kannmit regulären Zellkulturausrüstung, ohne die Notwendigkeit komplexer stimulierenden oder mechanische Vorrichtungen erreicht werden. Obwohl einige erfolgreich in vitro - Systemen haben 8,9, zu unserem Wissen berichtet wurde, ist dies das einzige Protokoll reifen Maus Muskelfasern mit T-Tubuli Erzeugung quer gepaart mit Retikulum (SR). Somit ist dieser in vitro - System kann die molekularen Mechanismen der Triade Bildung zu studieren verwendet werden, die immer noch schlecht 10 verstanden werden. Ein weiterer Vorteil dieses Systems zu verwenden, ist die Verfügbarkeit von validierten Maus-bezogene Ressourcen, wie beispielsweise Antikörper, Medikamente und RNAi-Tools. Die relativ einfaches Protokoll erfordert keine mühsamen Schritte, hoch qualifizierte Manipulation oder teure und spezielle Geräte. Gereift Muskelfasern beginnen nach 5 d der Kultur Differenzierung erscheinen 7, Kontraktilität Anzeige in Verbindung mit Calcium - Funken (nicht veröffentlichte Daten). In einer Woche, die unterschiedliche Entwicklungal Stufen eines der komplexesten Zellen in dem Säugetierkörper kann mit einer Vielzahl von in vitro - Assays in Kombination untersucht werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase&#160;type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>C9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM, Glutamax supplemented</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31980022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth reduced factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be &#60;1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP biomedical</td>
			<td>2850145</td>
			<td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant rat agrin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>550-AG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>11581831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>used to transfect siRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15338-100</td>
			<td>used to transfect DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668030</td>
			<td>used to transfect siRNA plus DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodishes</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>Science Services GmbH</td>
			<td>E15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 200ng/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			5 mg/ml collagenase 
			3.5 mg/ml dispase 
			sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			10% FBS 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			20% FBS 
			1% Chicken Embryo Extract 
			1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			2% Horse Serum 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			10% Goat Serum 
			5% BSA 
			add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

Skelettmuskeln bestehen aus Muskelfasern zusammengesetzt, die größten Zellen im Körper von Säugetieren und einer der wenigen Syncytien. Wie die komplexen und evolutionär konservierte Strukturen, die sie zusammensetzen zusammengebaut wird weiter untersucht. Ihre Größe und physiologischen Funktionen beschränken oft Manipulation und Imaging-Anwendungen. Die Kultur von immortalisierten Zelllinien, ist weit verbreitet, aber es kann nur die frühen Schritte der Differenzierung replizieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das einfache genetische Manipulation von Muskelfasern mit Ursprung aus primären Maus-Myoblasten ermöglicht. Nach einer Woche der Differenzierung zeigen die Muskelfasern Kontraktilität, ausgerichtet und Sarkomeren Triaden sowie peripheren Kerne. Die gesamte Differenzierungsprozess kann durch die Live-Darstellung oder Immunofluoreszenz folgen. Dieses System kombiniert die Vorteile der bestehenden ex vivo und in vitro - Protokolle. Die Möglichkeit der einfachen und effizienten Transfektion sowiedie Leichtigkeit der Zugriff auf alle Differenzierungsstufen erweitert die Anwendungsmöglichkeiten. Muskelfasern kann anschließend verwendet werden, nicht nur relevante Entwicklungs- und Zellbiologie Fragen zu beantworten, aber auch Muskelerkrankung Phänotypen für die klinische Anwendung zu reproduzieren.

Das Ausmaß der myofiber Entwicklung wird vor allem durch die Reinheit und Lebensfähigkeit der isolierten Myoblasten bestimmt. Die Adhäsion, Proliferation und Fusionskapazität kann empirisch verwendet werden , um diese Parameter zuzugreifen (Figur 1 A, B). Bei Proliferation D2 sollte Myoblasten haben eingehalten und sollte die typische fusiform Form anzuzeigen. Proliferation wird erwartet , umfassend in dieser Phase geschehen, was zu spontaner Bildung Myotube Am folgenden Tag (1B). Zellkonfluenz konnten geringfügige Anpassungen benötigen. Es sollte erhöht werden, wenn die Myoblasten mehr als 3 d nehmen sich zu vermehren und die Sicherung. Es sollte verringert werden, wenn Muskelfasern nicht erlaubt, zu wachsen und relativ gerade aufgrund ihrer Dichte zu verlängern. Konfluenz nimmt typischerweise von der Mitte zu dem Umfang der Schale, so dass die besten Muskelfasern sollten in Richtung der äußeren Bereiche gefunden werden. Myotuben wird schnell verlängern und die Anzeige mehrere zentral ausgerichteten Kerne (1C). Durch D5, beginnen einige Zellen Riefen und bewegen ihre Kerne an die Peripherie zu erwerben. Die Anzahl der Muskelfasern mit ausgereiften Eigenschaften werden mit der Zeit zunehmen sowie mit Zelldicke (1D). Der Grad der Differenzierung kann durch Immunofluoreszenz beobachtet werden. Muskelfasern an Differenzierung D8 Triaden vorhanden transversal fixiert. Dies kann durch Abbilden Komponenten der T-Tubuli (DPHR) und SR (Triadin) bestätigt werden, die erwartet werden , an den Triaden (Abbildung 2) zu co - lokalisieren. Die Funktionalität von Muskelfasern durch die Live-Darstellung angesprochen werden. Von Differenzierung D3 ab, zeigen die Zellen spontan Zucken. Durch Transfizieren eines Calciumsensor (zB., GCaMP6f 11) ist es möglich , zu beobachten , dass die Kontraktionen mit Calcium Spitzen gekoppelt (Abbildung 3). Mit diesem System konnten wir einen neuartigen molekularen Signalweg zu identifizieren , die in zentronukleäre Myopathien und myotonic dystrophies gestört wird, die somit 7 ein neues Ziel für innovative molekulare Therapien sein kann. Wir haben auch dieses Verfahren geeignet ist, die Entwicklung der neuromuskulären Synapse (NMJ) 12 zu studieren. Durch die Kokultur mit Rattenrückenmark Explantate haben wir eine Rolle für Dynein in NMJ Bildung 13 beschrieben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> Abbildung 1: Entwicklungsstadien der Myoblastenkultur. A) Auf Proliferation D2, Myoblasten haben geklebt und begann wuchernden. B) Bei prolifration D3, eine Konfluenz von 60 bis 80% erreicht ist, und Myoblasten spontan verschmelzen beginnen. C) Bei Differenzierung D3, Myotuben zentral gelegenen Kerne enthalten , sind vorherrschend. D) von Differenzierung D5 ab (zB Tag 8), starten Muskelfasern Riefen und peripheren Kerne aufweisen und beginnen zu verdicken. Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative konfokale Bild eines D8 myofiber immunostain. A) Immunostaining für Dihydropyridin Rezeptor (DHPR, oberes Feld) und Triadin (TRDN, Mitte). Eine Überlagerung der DHPR, TRDN und DAPI Kanäle zeigt Kolokalisation der Triade-Komponenten. B)<html> Ein Intensitätsprofil des in A. C gezogen gelbe Linie) ein 3D - Bild von Volumenrendering von Muskelfasern für α-Actinin (grün) und DAPI (blau gefärbt). Maßstabsbalken und Rasterweite: 5 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> Abbildung 3: Live - Imaging von Kalziumspiegel in Muskelfasern mit Spontane Zucken. A) High-Speed - Zeitraffer (20 - ms - Rahmen) Mikroskopie eines Calcium - Funken in einem Zucken myofiber. Calcium wurde durch die Expression GCaMP6f (Addgene Plasmids # 40755) nachgewiesen. B) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität über der Zeit für das Calciumsensor in Tafel A._blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

In vitro Differenzierung von Mature Muskelfasern für Live - Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

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Research

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Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

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Serie: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...