Name: in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging
Uploaded: 2017-01-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
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This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

HINWEIS: Eine Maus Erträge ausreichend Myoblasten für etwa zwei 35-mm-Schalen oder zwei Live-Imaging-Gerichte, so Plan Mattierungen, Dissektion und Beschichtung (Schritt 2.6) entsprechend. 10 Tiere - Da Myoblasten durch sequentielle Zentrifugationen und Vorabscheidungs ​​isoliert werden, sollte das Protokoll in Chargen von 5 erfolgen. Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Tierethikkommission im Instituto de Medicina Molecular und Universität Pierre et Marie Curie genehmigt 1. Dissection von neugeborenen Mäusen Hind Gliedmaßen Muskeln <ol><li> Bereiten Sie alle Lösungen im Voraus (Werkstoff - Tabelle) und sterilisieren durch Filtration (0,22 &amp; mgr; m - Filter). Sicherstellen , dass alle Medien , auf 37 ° C werden vor der Zugabe zu den Zellen, mit Ausnahme der Formulierungen Basalmembran - Matrix , die (beispielsweise Matrigel). </li><li> Sterilisieren Sie die Dissektion Material (je eine aus: gebogene Schere, gerade Schere, regelmäßige Zange,und Feinspitze Zange) und die Werkbank, indem sie mit 70% Ethanol abwischen. </li><li> Bereiten Sie eine 100 mm Petrischale mit 5 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) für das Muskel Sammlung und halten Sie sie auf Eis, bis die Zerkleinerungs- Schritt. </li><li> Enthaupten P6 - P8 Mäuse mit geraden Schere und sterilisieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Einschnitt in der Rückseite der Haut und ziehen Sie sie vorsichtig auf die Hinterbeine, bis sie entfernt wird, vollständig die Hinterschenkel-Muskulatur auszusetzen. </li><li> Verwenden Sie die Zange Fettgewebe zu entfernen, ohne die Muskeln zu beschädigen. </li><li> Um die Rückenhinterbeinmuskeln zu entfernen, halten Sie das Bein gestreckt und biegen Sie die Pfote an der Ferse Sehnen aus. Verwenden Sie die gebogene Schere zum Trennen von Muskel von Knochen, von den Sehnen beginnen, durch sanftes Gleiten und Schneiden nach oben. Excise die Muskeln und sie in gefrorener DPBS. </li><li> Isolieren Sie die Quadrizeps durch den Muskel mit Feinspitze Zange kneifen und schneiden um es ohne den Oberschenkelknochen oder das Kniegelenk zu beschädigen.</li><li> Nachdem alle Tiere seziert, gehen Sie sollten in einen sterilen Laminar-Flow-Zellkultur-Haube, wenn alle folgenden Schritte durchgeführt werden. </li></ol> 2. Myoblasten Isolation <ol><li> Entfernen Sie den Überschuss an DPBS. Mince das Gewebe mit sterilisiertem gebogene Schere, um eine einheitliche Masse zu erhalten. </li><li> Sammeln das zerkleinerte Gewebe in einer 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von 5 ml Verdauungsmischung und Inkubieren sie unter Rühren bei 37 ° C für 90 min. </li><li> Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 6 ml Dissektion Medium und Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 75 xg das verbleibende Gewebe zu pelletieren. </li><li> sammeln vorsichtig den Überstand. Achten Sie darauf, nicht Gewebedebris sammeln. Zentrifugieren es bei 350 xg für 5 min; Resuspendieren in 5 ml Dissektion Medium. </li><li> Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb. 25 ml Dissektion Medium und Vorbeschichtungszyklus sie in einem 150 - mm - Schale für 4 h in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO 2 &lt;/ Sub&gt;) die Fibroblasten zu ermöglichen, zu haften. </li><li> Während Vorplattieren mantel Gerichte mit 500 &amp; mgr; l Basalmembranmatrix 1: 100 verdünnt in kaltem IMDM für 1 h bei RT. Waschen Sie einmal mit DPBS und die Zellen Platte sofort (Schritt 2.8) oder verlassen mit Wachstumsmedium bis Plattierung. </li><li> Nach Vorplattieren, sammeln Sie den Überstand und Zentrifuge für 10 min bei 350 x g. </li><li> Resuspendieren sie in einem Wachstumsmedium und zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer. Stellen Sie die Lautstärke so, dass zwischen 150.000 und 250.000 Zellen pro Basalmembranmatrix beschichtete Schale ausgestrichen werden. Halten Sie die Zellen in einer Zellkultur-Inkubator. </li></ol> 3. myofiber Differenzierung HINWEIS: Nach 3 d, sollten die Zellen zu Sicherung und Form Myotuben bei etwa 70% Konfluenz (Abbildung 1B) beginnen. <ol><li> An diesem Punkt, um die Zellen zu transfizieren, falls gewünscht, mit einer siRNA oder DNA von Interesse. Wenn die Zellen nicht transfiziert werden, ändern Sie direkt an Differenzierungsmedium und Skip zu Schritt 3.4. </li><li> Transfizieren mit Transfektionsreagenzien den Anweisungen des Herstellers folgen. Inkubiere die Zellen für 5 h mit siRNA-Lipid-Komplexe (20 nM + 1 &amp; mgr; l Reagenz) oder DNA-Lipid-Komplexe (1 &amp; mgr; g + 1 &amp; mgr; l Reagenz). Optimieren Sie die siRNA und DNA-Konzentrationen, wenn nötig. </li><li> Waschen Sie sie einmal mit Differenzierungsmedium und wechseln Sie dann auf neue Differenzierungsmedium. </li><li> Am folgenden Tag, verdünnen Sie die Basalmembranmatrix 1: 2 in eiskaltem Differenzierungsmedium. Entfernen Sie das vorhandene Medium und mit 200 &amp; mgr; l eiskaltem Matrix zu jedem Gericht. </li><li> Inkubieren für 30 min in einem Zellkulturbrutschrank. </li><li> Ergänzen Sie die Differenzierungsmedium mit Agrin (100 ng / ml) und vorsichtig 2 ml zu den Zellen. </li><li> ändern Sie vorsichtig die Hälfte des Mediums alle 2 d, Ergänzung stets mit Agrin bis zu einer endgültigen Konzentration von 100 ng / ul. </li><li> Überwachen Sie die Zelldifferenzierung und Lebensfähigkeit. In Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren ab (wie FBS und chicken Embryo Extrakt Ursprung), könnte nehmen die Zellen zwischen 5-10 Differenzierung d vollständige Reifung (Abbildung 2) zu erreichen. </li></ol> 4. Immunostaining in Glasboden Geschirr <ol><li> Für die Immunfärbung, zu jeder Zeit-Punkt von Interesse, waschen Sie die einmal Zellen mit DPBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA bei RT für 10 min. </li><li> Waschen Sie sie zweimal mit DPBS. An diesem Punkt können die Zellen bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Permeabilisieren sie mit 0,5% Triton X-100 für 5 min bei RT. </li><li> Waschen Sie sie zweimal mit PBS und Block mit 30 min bei RT-blockierende Lösung. </li><li> Inkubieren sie mit dem primären Antikörper verdünnt in Blockierungslösung O / N bei 4 ° C. </li><li> Wasch 3x mit DPBS für 5 min bei RT. </li><li> Inkubieren sie mit dem sekundären Antikörper, und 0,2 &amp; mgr; g / ml DAPI für 1 h bei RT. </li><li> Wasch 3x mit DPBS für 5 min bei RT. </li><li> In 200 ul Eindeckmediums und fahren Sie mit Bildgebung. </li></ol>

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	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Verwendung dieses Protokolls für die Kultivierung von primären Myoblasten entsteht eine besondere Nische, die die Entwicklung von Muskelfasern stark fördert. Dies ist teilweise auf andere Zelltypen, die in sehr geringen Stückzahlen auch vorhanden sind. Ein Gleichgewicht zwischen Myoblasten Konzentration und Reinheit der Kultur erreicht werden muss. Eine gute Zellkultur hängt auch von der Qualität der Produkte für das Medium Formulierung verwendet. Alle Produkte aus tierischen Quellen stammen sollten gründlich geprüft werden. Nach unserer Erfahrung sollten die Aufschlussbedingungen überwacht werden. Wie üblich für Primärkulturen können experimentelle Variabilität höher sein als in den Studien mit isolierten Fasern oder unsterblich gemacht Myoblasten. Diese Variabilität kann durch die Standardisierung von mittleren und Verdauung Komponenten, Mäuse Alter und Größe, und die Zeitpunkte für die Manipulation der Kultur und Ergebnisse Sammlung vermindert werden. Dennoch ist der Vorteil der komplizierten Mechanismen in Echtzeit prüfendennotwendig für myofiber Entwicklung übertrifft deutlich die Variabilität Nachteil. Dieses Protokoll verleiht die Vorteile der in - vitro - Ansätze ohne Zelldifferenzierung zu beeinträchtigen. Reifen Muskelfasern bis Triaden gebildet werden und Kontraktionen Calcium Funken gekoppelt sind. Diese funktionellen Ausgänge können in verschiedenen experimentellen Bedingungen erreicht werden. Darüber hinaus kann es viele technische Variationen des Protokolls. Myoblasten können von neugeborenen Mäusen mit Mutationen von Interesse im Bereich der Muskelentwicklung geerntet werden. Die Zellen können für die biochemische Analyse an verschiedenen Differenzierungszeitpunkten aufgelöst werden. Calcium-Indikatoren können zu der Kultur hinzugefügt werden, um die Dynamik zu folgen. Optogenetische Konstrukte können verwendet werden, um bestimmte Signalwege zu erzwingen oder spezifische lokale Antworten zu induzieren. Schließlich können die Muskelfasern mit anderen Zellen kokultiviert werden Typen ihre Interaktionen zu studieren.

Skelettmuskel komponiert 1 bis 40% des menschlichen Körpergewichts. Muscle-assoziierten Erkrankungen stellen eine immense gesundheitliche und wirtschaftliche Belastung 2. Wie diese hochkomplexen und organisierte Gewebe gebildet wird, gehalten und regeneriert stellt ein umfangreiches und gut etabliertes Forschungsfeld. 6 - Abhängig von der spezifischen wissenschaftlichen Interesse, die am besten geeignete Ansatz kann von einfachen Myotubenkulturen bis hin zu komplexen in vivo - Modellen 3 reichen. Das Ziel des Protokolls ist es, ein in vitro - System zu schaffen , das für die Überwachung der Myogenese durch Echtzeit- Bildgebung und Immunofluoreszenz ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen bietet dieses System eine sehr komplette und dynamischen Einblick in die myogenen Prozess Maus. Die Zellen können aus der Myoblasten - Stufe zu der reifen, mehrkernige myofiber Anzeige transversal Triaden und peripheren Kerne 7 folgen. Diese Reifung Ebene kannmit regulären Zellkulturausrüstung, ohne die Notwendigkeit komplexer stimulierenden oder mechanische Vorrichtungen erreicht werden. Obwohl einige erfolgreich in vitro - Systemen haben 8,9, zu unserem Wissen berichtet wurde, ist dies das einzige Protokoll reifen Maus Muskelfasern mit T-Tubuli Erzeugung quer gepaart mit Retikulum (SR). Somit ist dieser in vitro - System kann die molekularen Mechanismen der Triade Bildung zu studieren verwendet werden, die immer noch schlecht 10 verstanden werden. Ein weiterer Vorteil dieses Systems zu verwenden, ist die Verfügbarkeit von validierten Maus-bezogene Ressourcen, wie beispielsweise Antikörper, Medikamente und RNAi-Tools. Die relativ einfaches Protokoll erfordert keine mühsamen Schritte, hoch qualifizierte Manipulation oder teure und spezielle Geräte. Gereift Muskelfasern beginnen nach 5 d der Kultur Differenzierung erscheinen 7, Kontraktilität Anzeige in Verbindung mit Calcium - Funken (nicht veröffentlichte Daten). In einer Woche, die unterschiedliche Entwicklungal Stufen eines der komplexesten Zellen in dem Säugetierkörper kann mit einer Vielzahl von in vitro - Assays in Kombination untersucht werden.

<table><tbody><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase&amp;nbsp;type V</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>C9263</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Glutamax supplemented</td><td>Gibco</td><td>31980022</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth reduced factor</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be &amp;lt;1.5</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>MP biomedical</td><td>2850145</td><td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td></tr><tr><td>Recombinant rat agrin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>550-AG-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>11581831</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>used to transfect siRNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX</td><td>Invitrogen</td><td>15338-100</td><td>used to transfect DNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668030</td><td>used to transfect siRNA plus DNA</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td><td>Science Services GmbH</td><td>E15710</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use at 200 ng/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions and Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Mix</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 5 mg/mL collagenase&lt;br/&gt; 3.5 mg/mL dispase&lt;br/&gt; sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dissection Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 10% FBS&lt;br/&gt; 1% Penicillin/Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Growth Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 20% FBS&lt;br/&gt; 1% Chicken Embryo Extract&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Differentiation Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 2% Horse Serum&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 10% Goat Serum&lt;br/&gt; 5% BSA&lt;br/&gt; add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

Skelettmuskeln bestehen aus Muskelfasern zusammengesetzt, die größten Zellen im Körper von Säugetieren und einer der wenigen Syncytien. Wie die komplexen und evolutionär konservierte Strukturen, die sie zusammensetzen zusammengebaut wird weiter untersucht. Ihre Größe und physiologischen Funktionen beschränken oft Manipulation und Imaging-Anwendungen. Die Kultur von immortalisierten Zelllinien, ist weit verbreitet, aber es kann nur die frühen Schritte der Differenzierung replizieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das einfache genetische Manipulation von Muskelfasern mit Ursprung aus primären Maus-Myoblasten ermöglicht. Nach einer Woche der Differenzierung zeigen die Muskelfasern Kontraktilität, ausgerichtet und Sarkomeren Triaden sowie peripheren Kerne. Die gesamte Differenzierungsprozess kann durch die Live-Darstellung oder Immunofluoreszenz folgen. Dieses System kombiniert die Vorteile der bestehenden ex vivo und in vitro - Protokolle. Die Möglichkeit der einfachen und effizienten Transfektion sowiedie Leichtigkeit der Zugriff auf alle Differenzierungsstufen erweitert die Anwendungsmöglichkeiten. Muskelfasern kann anschließend verwendet werden, nicht nur relevante Entwicklungs- und Zellbiologie Fragen zu beantworten, aber auch Muskelerkrankung Phänotypen für die klinische Anwendung zu reproduzieren.

Das Ausmaß der myofiber Entwicklung wird vor allem durch die Reinheit und Lebensfähigkeit der isolierten Myoblasten bestimmt. Die Adhäsion, Proliferation und Fusionskapazität kann empirisch verwendet werden , um diese Parameter zuzugreifen (Figur 1 A, B). Bei Proliferation D2 sollte Myoblasten haben eingehalten und sollte die typische fusiform Form anzuzeigen. Proliferation wird erwartet , umfassend in dieser Phase geschehen, was zu spontaner Bildung Myotube Am folgenden Tag (1B). Zellkonfluenz konnten geringfügige Anpassungen benötigen. Es sollte erhöht werden, wenn die Myoblasten mehr als 3 d nehmen sich zu vermehren und die Sicherung. Es sollte verringert werden, wenn Muskelfasern nicht erlaubt, zu wachsen und relativ gerade aufgrund ihrer Dichte zu verlängern. Konfluenz nimmt typischerweise von der Mitte zu dem Umfang der Schale, so dass die besten Muskelfasern sollten in Richtung der äußeren Bereiche gefunden werden. Myotuben wird schnell verlängern und die Anzeige mehrere zentral ausgerichteten Kerne (1C). Durch D5, beginnen einige Zellen Riefen und bewegen ihre Kerne an die Peripherie zu erwerben. Die Anzahl der Muskelfasern mit ausgereiften Eigenschaften werden mit der Zeit zunehmen sowie mit Zelldicke (1D). Der Grad der Differenzierung kann durch Immunofluoreszenz beobachtet werden. Muskelfasern an Differenzierung D8 Triaden vorhanden transversal fixiert. Dies kann durch Abbilden Komponenten der T-Tubuli (DPHR) und SR (Triadin) bestätigt werden, die erwartet werden , an den Triaden (Abbildung 2) zu co - lokalisieren. Die Funktionalität von Muskelfasern durch die Live-Darstellung angesprochen werden. Von Differenzierung D3 ab, zeigen die Zellen spontan Zucken. Durch Transfizieren eines Calciumsensor (zB., GCaMP6f 11) ist es möglich , zu beobachten , dass die Kontraktionen mit Calcium Spitzen gekoppelt (Abbildung 3). Mit diesem System konnten wir einen neuartigen molekularen Signalweg zu identifizieren , die in zentronukleäre Myopathien und myotonic dystrophies gestört wird, die somit 7 ein neues Ziel für innovative molekulare Therapien sein kann. Wir haben auch dieses Verfahren geeignet ist, die Entwicklung der neuromuskulären Synapse (NMJ) 12 zu studieren. Durch die Kokultur mit Rattenrückenmark Explantate haben wir eine Rolle für Dynein in NMJ Bildung 13 beschrieben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> Abbildung 1: Entwicklungsstadien der Myoblastenkultur. A) Auf Proliferation D2, Myoblasten haben geklebt und begann wuchernden. B) Bei prolifration D3, eine Konfluenz von 60 bis 80% erreicht ist, und Myoblasten spontan verschmelzen beginnen. C) Bei Differenzierung D3, Myotuben zentral gelegenen Kerne enthalten , sind vorherrschend. D) von Differenzierung D5 ab (zB Tag 8), starten Muskelfasern Riefen und peripheren Kerne aufweisen und beginnen zu verdicken. Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative konfokale Bild eines D8 myofiber immunostain. A) Immunostaining für Dihydropyridin Rezeptor (DHPR, oberes Feld) und Triadin (TRDN, Mitte). Eine Überlagerung der DHPR, TRDN und DAPI Kanäle zeigt Kolokalisation der Triade-Komponenten. B)<html> Ein Intensitätsprofil des in A. C gezogen gelbe Linie) ein 3D - Bild von Volumenrendering von Muskelfasern für α-Actinin (grün) und DAPI (blau gefärbt). Maßstabsbalken und Rasterweite: 5 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> Abbildung 3: Live - Imaging von Kalziumspiegel in Muskelfasern mit Spontane Zucken. A) High-Speed - Zeitraffer (20 - ms - Rahmen) Mikroskopie eines Calcium - Funken in einem Zucken myofiber. Calcium wurde durch die Expression GCaMP6f (Addgene Plasmids # 40755) nachgewiesen. B) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität über der Zeit für das Calciumsensor in Tafel A._blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

In vitro Differenzierung von Mature Muskelfasern für Live - Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K Aufrufe.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Serie: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Genetik

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Biologie

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Medizin

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

Hochdurchsatz-Kontraktionsmessungen von Hydrogel-eingebetteten intakten Muskelfasern der Maus mit einem optikbasierten System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...