Dieses Protokoll ist die effizienteste und kostengünstigste Methode zur genauen Kennzeichnung von Beta-Amyloid-Plaques im Vergleich zu Amyloid-spezifischen Antikörpern, die derzeit der Goldstandard für die Kennzeichnung dieser Plaques sind. Diese Technik nimmt weniger Zeit in Anspruch und ist genauso effektiv wie jede der häufig verwendeten Amyloid-Etikettierungsmethoden. Curcumin bindet stark an Amyloid-Plaques und kann als bildgebende Sonde während PET-Scans des Gehirns und für relativ nichtinvasive Screenings mit Netzhautscanning verwendet werden.
Curcumin bindet auch an neurofibrilläres oder Tau-Wirrwarr bei der Alzheimer-Krankheit, Alpha-Synuclein bei Parkinson und mutierte Huntington-Proteine bei der Huntington-Krankheit. Das Verfahren mit Panchanan Maiti demonstrieren Zackary Bowers, ein Student, und Alexandra Plemmons, eine Forscherin aus meinem Labor. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Schmerzreflex in einer anästhesierten 12 Monate alten Alzheimer-Krankheit Modell Maus, legen Sie die Maus in die Rückenposition auf einem Operationstablett und machen einen Schnitt in den Bauch und durch das Zwerchfell.
Setzen Sie eine 21 Gauge Perfusionsnadel in den Schnitt ein und machen Sie einen kleinen Schnitt an der rechten Ohrmuschel, damit die Perfusionsflüssigkeit aus dem Körper abfließen kann. Verwenden Sie ein schwerkraftgespeistes Perfusionssystem, um eiskalte 0,1 molige PBS-Flüssigkeit fünf bis sechs Minuten lang bei einem Durchfluss von 20 bis 25 Millilitern pro Minute in die Nadel fließen zu lassen. Wenn die Perfusion korrekt durchgeführt wird, wird eine klare Leber beobachtet.
Eine richtige tierische Perfusion ist wichtig, denn wenn das Blut nicht vollständig entfernt wird, kann Curcumin an die Blutgefäße binden und zu einem grünen fluoreszierenden Hintergrundsignal führen. Wenn alle PBS geliefert wurden, schalten Sie das Pufferventil für acht bis zehn Minuten auf eine eiskalte 4%Paraformaldehyd-Lösung um, bevor Sie Schere und Zange verwenden, um das Gehirn vom Schädel zu befreien. Dann verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn in eine Durchstechflasche mit 4% Paraformaldehyd mindestens 10 Mal das Gewebevolumen für vier Grad Celsius Lagerung bis zur Verarbeitung zu platzieren.
Um Abschnitte für Kryostatschnitte zu erhalten, tauchen Sie das Gehirn sequenziell in abgestufte Saccharoselösungen bei vier Grad Celsius für 24 Stunden pro Konzentration ein, bevor Sie einen Kryostat bei negativen 22 Grad Celsius verwenden, um 40 Mikrometerabschnitte zu erhalten, wobei 10 bis 20 Abschnitte pro Brunnen in eine sechs Bohrplatte mit PBS-Zusatz von 0,02 % Azid platziert werden, die sie erhalten. Wenn alle Proben erworben sind, lagern Sie die Abschnitte bei vier Grad Celsius bis zur WeiterenVerarbeitung. Um Abschnitte für Paraffinschnitt ehydrieren, dehydrieren Sie postfixiertes perfundiertes Hirngewebe mit sequenziellen gestuften Alkohollösungen für zwei Stunden pro Konzentration, gefolgt von zwei einstündigen 100%-Alkohol-Eintauchen und zwei einstündigen Xylol-Eintauchen bei Raumtemperatur.
Nach dem letzten Xylol-Eintauchen das Gewebe mit einem Eins-zu-Eins-Xylol-Paraffinlösung zweimal für eine Stunde pro Inkubation bei 56 Grad Celsius in einem mit Aluminiumfolie bedeckten Glas einzutauchen, bevor das Gewebe vier bis sechs Stunden in 56 Grad Celsius Paraffin getaucht wird. Verwenden Sie am Ende der Inkubation ein rotierendes Mikrotome bei Raumtemperatur, um fünf Mikrometer dicke Abschnitte zu erhalten, die die Abschnitte in ein 45 Grad Celsius-Gewebewasserbad legen, während sie gesammelt werden. Für die Curcumin-Kennzeichnung von Amyloid-Beta-Plaques in Kryostatgewebeabschnitten spülen Sie die Abschnitte mit PBS dreimal für fünf Minuten pro Wäsche ab, bevor Sie die Abschnitte zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in 70% Ethanol eintauchen.
Während die Abschnitte inkubieren, lösen Sie ein Millimolar von LagerCurcumin in Methanol auf und verdünnen Sie die Lösung auf eine Endarbeitskonzentration von 10 Mikromolaren mit 70% Ethanol. Am Ende der Inkubation tauchen Sie die Abschnitte in die arbeitende Curcumin-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur bei 50 Umdrehungen pro Minute ein. Am Ende der Färbezeit die Curcumin-Lösung entsorgen und die Abschnitte mit drei zweiminütigen Wäschen in 70% Ethanol waschen.
Nach der letzten Wäsche die Abschnitte auf polylysinbeschichtete Glasschlitten übertragen und einen Deckelschlupf mit einem geeigneten organischen Montagemedium auf jeden Schlitten montieren. Dann sehen Sie sich die Abschnitte auf einem Blütenstandmikroskop mit einem 10- oder 20-fachen Objektiv und den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern an. Für die histochemische Etikettierung von tiefen paraffinierten Gewebeabschnitten tauchen Sie die fünf Mikrometer dicken Abschnitte zweimal für fünf Minuten bei Raumtemperatur pro Eintauchen in Xylol ein, gefolgt von einer Rehydratation mit abgestuften einminütigen Eintauchen in Alkohollösung.
Am Ende der Inkubation die Abschnitte mit abgestuften Alkohollösungen für zwei Minuten pro Konzentration waschen, gefolgt von einer Lichtung mit zwei fünfminütigen Xylol-Eintauchen. Nach dem zweiten Xylol-Eintauchen, montieren Sie jeden Abschnitt auf einem Mikroskopschlitten mit einem Deckschlitten und einem geeigneten Montagemedium für die Floreszenzmikroskopie-Bildgebung, wie gezeigt. Zur Kennzeichnung von Kryostatabschnittsproben mit Anti-A-Beta-Antikörpern die Proben dreimal mit frischen PBS pro Waschgang in einzelnen Brunnen einer 12-Well-Platte waschen, bevor Sie eine unspezifische Bindung mit 10% normalem Ziegenserum in PBS und 0,5%Triton x-100 für eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren.
Entsorgen Sie am Ende der Inkubation die Blockierlösung und inkubieren Sie die Proben mit einem betaspezifischen Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius und 150 Umdrehungen pro Minute. Am nächsten Morgen die Abschnitte mit drei 10-minuten-Waschungen in frischem PBS pro Waschgang waschen, gefolgt von einer Inkubation mit einem geeigneten Sekundärantikörper, der mit einem roten Fluorophor konjugiert ist, für eine Stunde bei Raumtemperatur, die vor Licht geschützt ist. Am Ende der Inkubation die Abschnitte dreimal mit PBS waschen, gefolgt von einer Wäsche mit 70% Alkohol.
Nach dem Alkoholwaschen die Abschnitte mit 10 Mikromolar Curcumin für 10 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten, gefolgt von drei einminütigen 70%Alkoholwäsche. Nach der letzten Wäsche die Abschnitte mit 90% und 100% Alkohol für eine Minute pro Konzentration dehydrieren und die Abschnitte zweimal für fünf Minuten pro Eintauchen mit frischem Xylol pro Inkubation löschen. Montieren und bebilden Sie dann die Abschnitte, wie gezeigt.
Für intrazelluläre Amyloid-Co-Lokalisierung, färben Sie die Abschnitte mit Anti-Amyloid-Beta-Antikörper gefolgt von Färbung mit Curcumin bei Raumtemperatur und 50 Rotationen pro Minute vor Licht geschützt, wie gezeigt. Am Ende der Inkubation mit einem geeigneten Kernfarbstoff für 10 Minuten bei Raumtemperatur und 50 Umdrehungen pro Minute vor Licht geschützt, gefolgt von drei Waschungen in PBS. Dann montieren und abbilden Sie die Abschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie, wie gezeigt.
Obwohl die Erhöhung der Inkubationszeit mit Curcumin die Fluoreszenzintensität der A-Beta-Plaques leicht erhöht, unterscheidet sich die Anzahl der beobachteten Plaques zwischen einer und fünf Minuten Färbungszeit nicht signifikant. Curcumin kann verwendet werden, um A Beta-Plaques und kryosectioned, Paraffin eingebettet, und menschliche Alzheimer-Krankheit Gewebeproben zu färben. Die Etikettierung mit einem betaspezifischen Antikörper vor der Curcuminfärbung zeigt, dass das Curcumin vollständig mit A beta an den gleichen Plaques kolokalisiert ist, die den Antikörper binden.
Nach der Färbung mit Curcumin mit der Bezeichnung A Beta-Oligomere kann Curcumin-Co-Lokalisierung mit den Oligomeren in A-Beta-Plaques beobachtet werden. In ähnlicher Weise lokalisiert Curcumin auch mit dem A beta-spezifischen Antikörper in intrazellulären Räumen, was bestätigt, dass der Fleck intrazelluläre A-Beta kennzeichnen kann. Curcumin-Etikettierung ist auch prominenter als herkömmliche Amyloid-Bindungfarbstoffe.
Curcumin-Derivate in tumerischen Extrakten Gefunden Label A Beta-Plaques vergleichsweise Curcumin in menschlichen Alzheimer-Krankheit Gehirngewebe unabhängig von der Art der Montagemedium verwendet. Darüber hinaus werden Curcumin-Immunfluoreszenzsignale und Gegenfärbungsintensität auch nach der Färbung mit typischen kerntechnischen Flecken und anderen Zellmarkern beibehalten. Wir trafen, dass konstante Abschnitte dünner als 40 Mikrometer sein sollten.
Dieses Training sollte unter 30 Minuten gehalten werden und die optimale Curcumin-Konzentration ist ein bis zwei Mikromolar. Doppelte Nivellierung verzögertbiomarker können auf dem gleichen Gewebe durchgeführt werden und können eine größere Spezifität bieten, welche Arten von Gehirnzellen nivelliert werden. Angesichts der Tatsache, dass Curcumin die Amyloid-Plaque-Last reduzieren kann, werden die genauen Mechanismen, wie dieser Prozess abläuft, derzeit sowohl auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene untersucht.
