이 프로토콜은 현재 이러한 플라크 라벨링에 대한 금 본위제인 아밀로이드 특이 적 항체와 비교하여 베타 아밀로이드 플라크를 정확하게 라벨링하는 가장 효율적이고 비용 효율적인 방법입니다. 이 기술은 시간이 적게 걸리며 일반적으로 사용되는 아밀로이드 라벨링 방법과 마찬가지로 효과적입니다. Curcumin 강하게 아밀로이드 플라크에 결합하고 두뇌의 PET 검사 도중 및 망막 스캐닝을 사용하여 상대적으로 비침습적인 검열을 위해 화상 진찰 프로브로 이용될 수 있습니다.
커큐민은 또한 알츠하이머 병의 신경 섬유성 또는 타우 엉킴, 파킨슨 병의 알파 시뉴클레인, 헌팅턴 병의 돌연변이 헌팅턴 단백질에 결합합니다. 판차난 마이티와 함께 절차를 시연하는 것은 재커리 보워스, 대학원생, 그리고 알렉산드라 플레몬스, 내 실험실에서 연구 과학자가 될 것입니다. 마취 된 12 개월 된 알츠하이머 병 모델 마우스에서 통증 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 수술 트레이에 supine 위치에 마우스를 배치하고 복부와 횡격막을 통해 절개를합니다.
절개에 21 게이지 관류 바늘을 삽입하고 관류 유체가 몸에서 배출 할 수 있도록 오른쪽 오리지클에 작은 절개를합니다. 중력 공급 관류 시스템을 사용하여 얼음 차가운 0.1 어금 PBS 유체가 분당 20~25밀리리터로 5~6분 동안 바늘로 흐를 수 있도록 합니다. 관류가 올바르게 수행되면 맑은 간이 관찰됩니다.
혈액이 완전히 제거되지 않으면 커큐민이 혈관에 결합되어 녹색 형광 배경 신호를 초래할 수 있기 때문에 적절한 동물 관류가 필수적입니다. 모든 PBS가 전달되면 완충 밸브를 얼음 차가운 4% 파라포름알데히드 용액으로 전환한 후 가위와 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 풀어보도록 합니다. 그런 다음 주걱을 사용하여 뇌를 4% 파라포름알데히드의 유리병에 넣고 처리전까지 4도 저장을 위해 조직 부피의 10배 이상을 차지합니다.
저온염 단면에 대한 섹션을 얻으려면, 40 마이크로 미터 섹션을 얻기 위해 음의 22도에서 극저온을 사용하기 전에 농도당 24 시간 동안 44 섭씨에서 등급 자당 용액에 뇌를 순차적으로 몰입, 그들은 얻을로 보충 PBS를 포함하는 6 개의 잘 플레이트에 잘 10 ~ 20 섹션을 배치 0.02%azide. 모든 샘플을 획득하면 추가 처리가 될 때까지 섹션을 섭씨 4도에 저장합니다. 파라핀 단면에 대한 섹션을 얻으려면 농도당 2시간 동안 순차적인 등급의 알코올 용액을 가진 고정 후 침투 뇌 조직을 탈수하고, 1시간 100% 알코올 몰입및 실온에서 1시간 자일렌 몰입 2개가 뒤따릅니다.
마지막 자일렌 몰입 후, 4 ~ 6 시간 동안 56섭씨 파라핀에 침전하기 전에 알루미늄 호일로 덮인 유리 원뿔 유리에 56도에서 잠복당 1 ~1 자일렌으로 조직을 관통하십시오. 인큐베이션의 끝에서, 그들은 수집으로 45섭씨 조직 수조에 섹션을 배치 다섯 마이크로 미터 두께섹션을 얻기 위해 실온에서 회전 마이크로 토메를 사용합니다. 극저온 조직 섹션에서 아밀로이드 베타 플라크의 커큐민 라벨링의 경우, 실온에서 2 분 동안 70 %에탄올에 섹션을 몰입하기 전에 세척 당 5 분 동안 PBS로 섹션을 세 번 헹구습니다.
섹션이 인큐베이팅하는 동안, 메탄올에 주식 커큐민 의 1 밀리몰라를 용해하고 70 %의 에탄올과 10 마이크로 몰라의 최종 작업 농도로 용액을 희석. 인큐베이션이 끝나면 작업 커큐민 용액에 분당 50회전시 실온에서 10분 동안 섹션을 담급니다. 염색 기간이 끝나면 커큐민 용액을 버리고 70 % 에탄올로 3 2 분 세척으로 섹션을 씻으십시오.
마지막 세척 후, 폴리리신 코팅 유리 슬라이드에 섹션을 전송하고 적절한 유기 장착 매체와 각 슬라이드에 커버 슬립을 장착. 그런 다음 10 또는 20배 목표및 적절한 흥분 및 방출 필터를 사용하여 플로레시네이션 현미경의 섹션을 봅니다. 깊은 파라핀 조직 섹션의 조직 화학 라벨링을 위해, 침수 당 실온에서 5 분 동안 자일렌에 있는 5 마이크로 미터 두께의 섹션을 두 번, 그리고 등급1 분 알코올 용액 몰입으로 재수화.
인큐베이션이 끝나면 농도당 2분 동안 등급이 매겨진 알코올 용액으로 섹션을 세척한 다음 2개의 5분 자일렌 몰입으로 청소합니다. 두 번째 자일렌 침지 후, 입증 된 바와 같이 플로레시즘 현미경 이미징에 대한 커버 슬립과 적절한 장착 매체와 현미경 슬라이드에 각 섹션을 마운트. 항A-베타 항체를 가진 극저온 단면도 표본의 라벨링을 위해, PBS에서 10%의 일반 염소 세럼으로 비특이적 결합을 차단하기 전에 12웰 플레이트의 개별 우물에서 세척당 신선한 PBS로 샘플을 세 번 세척하고 실온에서 1시간 동안 0.5%트리톤 x-100을 허용합니다.
인큐베이션이 끝나면 차단 용액을 폐기하고 베타 특이항체로 샘플을 하룻밤 사이에 섭씨 4도 및 분당 150회전으로 배양한다. 다음 날 아침, 세척당 신선한 PBS로 3 개의 10 분 세척으로 섹션을 씻은 다음 빛으로부터 보호되는 실온에서 1 시간 동안 적색 불소로 공조된 적절한 이차 항체로 인큐베이션을 합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS로 섹션을 세 번 씻고 70 %의 알코올로 한 번 씻습니다.
알코올 세척 후 실온에서 10 분 동안 10 마이크로 몰러 커큐민으로 섹션을 배양한 다음 3 분 70 %의 알코올 세척을 합니다. 마지막 세척 후, 농도 당 1 분 동안 90 %와 100 % 알코올로 섹션을 탈수하고 인큐베이션 당 신선한 자일렌과 침수 당 5 분 동안 섹션을 두 번 취소합니다. 그런 다음 설명된 대로 섹션을 마운트하고 이미지화합니다.
세포 내 아밀로이드 베타 공동 국소화를 위해, 항 아밀로이드 베타 항체로 섹션을 얼룩지게 한 다음 실온에서 커큐민으로 염색하고 빛으로부터 보호되는 분당 50 회전이 입증된 바와 같이. 인큐베이션이 끝나면 실온에서 10분 동안 적절한 핵염을 가진 카운터스테인과 분당 50회 회전이 빛으로부터 보호된 다음 PBS에서 세 번의 세척을 합니다. 그런 다음 형광 현미경 검사법에 의해 섹션을 마운트및 이미지화하여 입증된 바와 같이.
커큐민으로 잠복시간을 늘리면 A베타 플라크의 형광 강도가 약간 증가하지만, 관찰된 플라크의 수는 염색 시간의 1~5분 사이에 크게 다르지 않다. 커큐민은 베타 플라크와 저온절제, 파라핀 내장, 인간 알츠하이머 병 조직 샘플을 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 커큐민 염색 전에 베타 특이적 항체로 라벨링하면 커큐민이 항체를 묶는 동일한 플라크에서 베타와 완전히 공동 국화된다는 것을 알 수 있다.
curcumin 라벨 베타 올리고머로 염색 한 후, 올리고머와 커큐민 공동 국소화는 베타 플라크에서 관찰 될 수있다. 유사하게, 커큐민은 또한 세포내 공간에서 A 베타 특이적 항체와 공동 국소화하여 얼룩이 세포내 A 베타에 라벨을 붙일 수 있음을 확인한다. 커큐민 라벨링은 또한 기존의 아밀로이드 결합 염료보다 더 두드러지다.
Tumeric 추출물 라벨A 베타 플라크에서 발견되는 커큐민 유도체는 사용되는 장착 배지의 종류에 관계없이 인간 알츠하이머 병 뇌 조직에서 비교적 커큐민을 치료하기 위해 베타 플라크를 표시합니다. 또한, 커큐민 면역형광신호 및 반염색 강도는 일반적인 핵얼룩 및 기타 세포 마커로 염색한 후에도 유지된다. 우리는 일정한 단면이 40 미크론 보다는 더 얇아야 한다는 것을 만났습니다.
이 훈련 절차는 30 분 이내에 보관해야하며 최적의 커큐민 농도는 1 ~ 2 개의 마이크로 몰러입니다. 이중 레벨링 지체 바이오마커는 동일한 조직에서 수행될 수 있으며 뇌 세포의 종류가 평준화되는 더 큰 특이성을 제공할 수 있습니다. 커큐민이 아밀로이드 플라크 부하를 줄일 수 있다는 점을 감안할 때, 이 과정이 어떻게 발생하는지에 대한 정확한 메커니즘은 현재 세포 및 분자 수준 모두에서 조사되고 있습니다.
