Este protocolo é o método mais eficiente e econômico para rotular com precisão placas beta-amilóides, em comparação com anticorpos específicos amiloides, que atualmente são o padrão-ouro para rotular essas placas. Esta técnica leva menos tempo e é tão eficaz quanto qualquer um dos métodos de rotulagem amiloide comumente usados. A curcumina se liga fortemente a placas amiloides e pode ser usada como uma sonda de imagem durante tomografias pet do cérebro e para triagens relativamente não invasivas usando escaneamento da retina.
A curcumina também se liga ao emaranhado neurofibrilar ou tau na doença de Alzheimer, à sinucleína alfa na doença de Parkinson e às proteínas mutantes de Huntington na doença de Huntington. Demonstrando o procedimento com Panchanan Maiti estarão Zackary Bowers, uma estudante de pós-graduação, e Alexandra Plemmons, uma cientista de pesquisa do meu laboratório. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo da dor em um camundongo modelo de doença de Alzheimer anestesizado de 12 meses, coloque o rato na posição supina em uma bandeja de cirurgia e faça uma incisão no abdômen e através do diafragma.
Insira uma agulha de perfusão de 21 bitolas na incisão e faça uma pequena incisão na aurícula direita para permitir que o fluido de perfusão escorra do corpo. Use um sistema de perfusão alimentado por gravidade para permitir que o líquido PBS molar 0,1 molar flua para dentro da agulha por cinco a seis minutos a uma taxa de fluxo de 20 a 25 mililitros por minuto. Se a perfusão for realizada corretamente, um fígado claro será observado.
Uma perfusão animal adequada é essencial porque se o sangue não for completamente removido, a curcumina pode se ligar aos vasos sanguíneos e resultar em um sinal de fundo fluorescente verde. Quando toda a PBS tiver sido entregue, troque a válvula tampão para uma solução de 4% de paraformaldeído gelado por oito a 10 minutos antes de usar tesouras e fórceps para libertar o cérebro do crânio. Em seguida, use uma espátula para colocar o cérebro em um frasco de 4% de paraformaldeído pelo menos 10 vezes o volume de tecido para quatro graus celsius de armazenamento até o processamento.
Para obter seções para seção de criostat, imergir seqüentemente o cérebro em soluções de sacarose classificadas a quatro graus celsius por 24 horas por concentração antes de usar um criostat a 22 graus celsius negativos para obter seções de 40 micrômetros, colocando 10 a 20 seções por poço em uma placa de seis poços contendo PBS complementada com 0,02% de azida como são obtidas. Quando todas as amostras tiverem sido adquiridas, armazene as seções a quatro graus celsius até um processamento posterior. Para obter seções para secção de parafina, desidratar tecido cerebral perfusado pós-fixado com soluções de álcool de grau sequencial por duas horas por concentração, seguido por duas imersões de álcool de uma hora e 100% e duas imersões de xileno de uma hora à temperatura ambiente.
Após a última imersão de xileno, penetre o tecido com um xileno de um a um parafina duas vezes por uma hora por incubação a 56 graus celsius em um vidro cônico de vidro coberto com papel alumínio antes de imergir os tecidos em parafina de 56 graus celsius por quatro a seis horas. No final da incubação, use um microtome rotativo à temperatura ambiente para obter cinco seções de espessura de micrômetro colocando as seções em um banho de água de tecido de 45 graus celsius à medida que são coletadas. Para rotulagem de curcumina de placas beta amiloides em seções de tecido criostat, enxágue as seções com PBS três vezes por cinco minutos por lavagem antes de imergir as seções em 70% de etanol por dois minutos à temperatura ambiente.
Enquanto as seções estão incubando, dissolva um milimão de curcumina de estoque em metanol e dilua a solução para uma concentração final de trabalho de 10 micromolar com 70% de etanol. Ao final da incubação, mergulhe as seções na solução de curcumina de trabalho por 10 minutos à temperatura ambiente a 50 rotações por minuto. Ao final do período de coloração, descarte a solução de curcumina e lave as seções com três lavagens de dois minutos em 70% de etanol.
Após a última lavagem, transfira as seções para lâminas de vidro revestidas de polilise e monte um deslizamento de cobertura em cada slide com um meio de montagem orgânico apropriado. Em seguida, visualize as seções em um microscópio florescence usando um objetivo de 10 ou 20x e os filtros de excitação e emissão apropriados. Para rotulagem histoquímica de seções profundas de tecido parafinado, mergulhe as cinco seções de espessura de cinco micrômetros em xileno duas vezes por cinco minutos à temperatura ambiente por imersão, seguida de reidratação com imersões de solução alcoólica de um minuto.
Ao final da incubação, lave as seções com soluções de álcool classificadas por dois minutos por concentração, seguida de compensação com duas imersões de xileno de cinco minutos. Após a segunda imersão de xileno, monte cada seção em um slide de microscópio com um deslizamento de cobertura e um meio de montagem apropriado para imagens de microscopia florescence, como demonstrado. Para rotular amostras de seção criostata com anticorpos anti-A-beta, lave as amostras três vezes com PBS fresco por lavagem em poços individuais de uma placa de 12 poços antes de bloquear qualquer ligação não específica com soro de cabra 10% normal em PBS e 0,5% triton x-100 por uma hora à temperatura ambiente.
Ao final da incubação, descarte a solução de bloqueio e incuba as amostras com anticorpo específico a-beta durante a noite a quatro graus celsius e 150 rotações por minuto. Na manhã seguinte, lave as seções com três lavagens de 10 minutos em PBS fresco por lavagem, seguida de incubação com um anticorpo secundário apropriado conjugado com um fluorohore vermelho por uma hora à temperatura ambiente protegido da luz. Ao final da incubação, lave as seções três vezes com PBS seguida de uma lavagem com 70% de álcool.
Após a lavagem do álcool, incubar as seções com 10 curcumina micromolar por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido por três banhos de álcool de um minuto e 70%. Após a última lavagem, desidrate as seções com 90% e 100% de álcool por um minuto por concentração e limpe as seções duas vezes por cinco minutos por imersão com xileno fresco por incubação. Em seguida, monte e imagem as seções como demonstrado.
Para co-localização beta amiloide intracelular, colorir as seções com anticorpo beta anti-amilóide seguido de coloração com curcumina à temperatura ambiente e 50 rotações por minuto protegidas da luz como demonstrado. No final da incubação, contra-ataque com um corante nuclear apropriado por 10 minutos à temperatura ambiente e 50 rotações por minuto protegidas da luz seguidas por três lavagens em PBS. Em seguida, monte e imagem as seções por microscopia de fluorescência como demonstrado.
Embora o aumento do tempo de incubação com curcumina aumente ligeiramente a intensidade da fluorescência das placas beta A, o número de placas observadas não é significativamente diferente entre um e cinco minutos de tempo de coloração. A curcumina pode ser usada para manchar placas beta e criosectioned, parafina incorporada e amostras de tecido da doença de Alzheimer humano. Rotulagem com um anticorpo beta específico antes da coloração de curcumina revela que a curcumina é completamente co-localizada com Beta nas mesmas placas que ligam o anticorpo.
Após a coloração com curcumina rotulada A beta oligômeros, a co-localização da curcumina com os oligômeros pode ser observada em placas beta A. Da mesma forma, a curcumina também co-localiza com o anticorpo beta específico A em espaços intracelulares, confirmando que a mancha pode rotular beta intracelular. A rotulagem de curcumina também é mais proeminente do que os corantes convencionais de ligação amiloide.
Derivados de curcumina encontrados em extratos úmeros rotulam A placas beta comparativamente à curcumina no tecido cerebral da doença de Alzheimer humana, independentemente do tipo de meio de montagem utilizado. Além disso, os sinais de imunofluorescência de curcumina e a intensidade de contra-retenção são mantidos mesmo após a coloração com manchas nucleares típicas e outros marcadores celulares. Nós conhecemos que seções constantes devem ser mais finas do que 40 mícrons.
Este procedimento de treinamento deve ser mantido em menos de 30 minutos e a concentração ideal de curcumina é de um a dois micromolar. Biomarcadores retardados de duplo nivelamento podem ser realizados no mesmo tecido e podem fornecer uma maior especificidade de quais tipos de células cerebrais estão sendo niveladas. Dado que a curcumina pode reduzir a carga da placa amiloide, os mecanismos precisos de como esse processo ocorre estão sendo investigados atualmente nos níveis celular e molecular.
