Bu protokol, şu anda bu plakların etiketlanmasında altın standart olan amiloid spesifik antikorlarla karşılaştırıldığında, beta-amiloid plakları doğru bir şekilde etiketlemek için en etkili ve uygun maliyetli yöntemdir. Bu teknik daha az zaman alır ve yaygın olarak kullanılan amiloid etiketleme yöntemleri nin herhangi biri kadar etkilidir. Curcumin güçlü amiloid plaklar bağlanır ve beynin PET taramaları sırasında bir görüntüleme prob olarak kullanılabilir ve retina taraması kullanarak nispeten noninvaziv taramaları için.
Curcumin ayrıca Alzheimer hastalığında nörofibrillary veya tau tangle bağlanır, Parkinson hastalığında alfa sinüklein, ve Huntington hastalığında mutant Huntington proteinleri. Panchanan Maiti ile prosedürü gösteren Zackary Bowers, bir lisansüstü öğrenci ve Alexandra Plemmons, benim laboratuvar bir araştırma bilim adamı olacaktır. Anestezi 12 aylık Alzheimer hastalığı model fare ağrı refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, bir ameliyat tepsisinde supine pozisyonda fare yerleştirin ve karın içine bir kesi yapmak ve diyafram yoluyla.
Kesiye 21 gauge perfüzyon iğnesi yerleştirin ve perfüzyon sıvısının vücuttan boşalmasını sağlamak için sağ auricle'da küçük bir kesi yapın. Buz soğuğu 0,1 molar PBS sıvısının dakikada 20 ila 25 mililitre lik bir hızda beş ila altı dakika boyunca iğneye akmasını sağlamak için yer çekimiyle beslenen perfüzyon sistemini kullanın. Perfüzyon doğru yapılırsa, net bir karaciğer gözlenecektir.
Kan tamamen çıkarılmaz, çünkü uygun bir hayvan perfüzyonu esastır, kurkumin kan damarlarına bağlı olabilir ve yeşil floresan arka plan sinyali neden olabilir. Tüm PBS teslim edildiğinde, beyni kafatasından kurtarmak için makas ve forseps kullanmadan önce tampon valfi 8 ila 10 dakika boyunca buz gibi %4 paraformaldehit çözeltisine geçirin. Sonra işleme kadar dört derece santigrat depolama için doku hacminin en az 10 katı doku hacmi% 4 paraformaldehit bir şişe içine beyin yerleştirmek için bir spatula kullanın.
Kriyostat kesitleri elde etmek için, 40 mikrometre kesitelde etmek için negatif 22 santigrat derecede kriyostat kullanmadan önce konsantrasyon başına 24 saat boyunca dört derece sakaroz çözeltilerinde beyni sırayla daldırın ve elde edilen %0,02 azit ile desteklenen PBS içeren altı kuyu plakasına 10 ila 20 bölüm yerleştirin. Tüm numuneler elde edildiğinde, bölümleri daha fazla işleme alınana kadar dört derece saklayın. Parafin kesiti için kesitler elde etmek için, konsantrasyon başına iki saat sıralı dereceli alkol çözeltileri ile sabit perfüzyon beyin dokusu dehydrate, iki bir saat 100% alkol daldırma ve oda sıcaklığında iki bir saat ksilen daldırma izledi.
Son ksilen daldırma sonra, dört ila altı saat boyunca 56 derece santigrat parafin dokuları daldırma önce alüminyum folyo ile kaplı bir cam konik cam 56 santigrat derece kuluçka başına bir saat için parafin çözeltisi için bir-bir ksilen ile doku nüfuz. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında bir döner mikrotom kullanarak, bölümleri 45 derecelik doku su banyosuna yerleştiren beş mikrometre kalınlığında kesit elde edin. Kriyostat doku bölümlerinde amiloid beta plaklarının curcumin etiketlemesi için, oda sıcaklığında iki dakika boyunca %70 etanol deki bölümleri daldırmadan önce, yıkama başına beş dakika boyunca PBS ile bölümleri üç kez durulayın.
Bölümler kuluçka yadaken, metanol stok curcumin bir milimolar eritmek ve% 70 etanol ile 10 mikromolar son çalışma konsantrasyonu için çözelti seyreltmek. Kuluçka sonunda, çalışma curcumin çözeltisi içinde 10 dakika oda sıcaklığında dakikada 50 rotasyon larda bölümleri batırın. Boyama periyodunun sonunda, kurkumin çözeltisini atın ve %70 etanolde üç iki dakikalık yıkama ile bölümleri yıkayın.
Son yıkamadan sonra, bölümleri polilizin kaplı cam kaydıraklara aktarın ve uygun bir organik montaj ortamı ile her slaytüzerine bir kapak fişi yerleştirin. Daha sonra 10 veya 20x hedefi ve uygun uyarma ve emisyon filtreleri kullanarak floresan mikroskop üzerindeki bölümleri görüntüleyin. Derin parafinize doku bölümlerinin histokimyasal etiketlemesi için, beş mikrometre kalınlığındaki kesitleri her daldırma oda sıcaklığında beş dakika boyunca iki kez ksilen içine daldırın, ardından bir dakikalık alkol solüsyonu daldırmalarla rehidrasyon devam edin.
Kuluçka sonunda, konsantrasyon başına iki dakika dereceli alkol çözeltileri ile bölümleri yıkayın ve ardından iki beş dakikalık ksilen daldırma ile temizleyin. İkinci ksilen daldırma sonra, bir kapak kayma ve floresan mikroskop görüntüleme için uygun bir montaj ortamı ile bir mikroskop slayt her bölümü monte gösterildiği gibi. Kriyostat kesit örneklerinin anti-A-beta antikorlarla etiketlemesi için, pbs'de %10 normal keçi serumu ve oda sıcaklığında bir saat boyunca %0,5 triton x-100 ile spesifik olmayan herhangi bir bağlayıcılığı engellemeden önce numuneleri 12 kuyu plakasının ayrı kuyularında yıkama başına üç kez taze PBS ile yıkayın.
Kuluçka sonunda, bloke çözeltisini atın ve numuneleri bir gecede dört derece santigrat derece ve dakikada 150 dönüşle a-beta spesifik antikorile kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, yıkama başına taze PBS üç 10 dakikalık yıkar ile bölümleri yıkayın, uygun bir ikincil antikor ile kuluçka oda sıcaklığında bir saat boyunca kırmızı bir florofor ile konjuge ışıktan korunan. Kuluçka sonunda, pbs ile üç kez bölümleri yıkayın ve ardından % 70 alkol ile bir yıkama.
Alkol yıkandıktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10 mikromolar curcumin ile bölümleri kuluçkaya yatırın ve ardından üç adet bir dakika %70 alkol yıkanır. Son yıkamadan sonra, konsantrasyon başına bir dakika için %90 ve %100 alkol içeren bölümleri kurutun ve kuluçka başına taze ksilen ile daldırma başına beş dakika boyunca bölümleri iki kez temizleyin. Daha sonra bölümleri gösterildiği gibi monte edin ve görüntüleyin.
Hücre içi amiloid beta kolokalizasyonu için, anti amiloid beta antikor ile kesitleri leke ve ardından oda sıcaklığında kurkumin ile boyama ve gösterildiği gibi ışıktan korunan dakikada 50 rotasyon. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında 10 dakika uygun bir nükleer boya ile karşı leke ve Dakikada 50 dönüşler PBS üç yıkar takip ışıktan korunan. Daha sonra floresan mikroskopi ile bölümleri monte edin ve görüntüleyin.
Kurkumin ile kuluçka süresini artırmak A beta plaklarının floresan şiddetini biraz artırsa da, gözlenen plakların sayısı bir ile beş dakikalık boyama süresi arasında anlamlı olarak farklı değildir. Curcumin bir beta plaklar ve kriyosectioned leke için kullanılabilir, parafin gömülü, ve insan Alzheimer hastalığı doku örnekleri. Kurkumin boyama önce A beta spesifik antikor ile etiketleme kurkumin tamamen antikor bağlamak aynı plaklarda bir beta ile birlikte lokalize olduğunu ortaya koymaktadır.
Beta oligomer etiketli curcumin ile boyandıktan sonra, a beta plaklarında oligomerlerle kurkumin ko-lokalizasyonu görülebilir. Benzer şekilde, curcumin de hücre içi alanlarda A beta spesifik antikor ile birlikte lokalize, leke hücre içi A beta etiketolabilir doğrulayan. Curcumin etiketleme de konvansiyonel amiloid bağlayıcı boyalar daha belirgindir.
Tumeric özleri etiket bulunan curcumin türevleri kullanılan montaj ortamının türüne bakılmaksızın insan Alzheimer hastalığı beyin dokusunda curcumin nispeten bir beta plaklar. Buna ek olarak, curcumin immünoresans sinyalleri ve karşı boyama yoğunluğu bile tipik nükleer lekeler ve diğer hücre belirteçleri ile boyama sonra korunur. Sabit bölümlerin 40 mikrondan daha ince olması gerektiğini gördük.
Bu eğitim prosedürü 30 dakika nın altında tutulmalıdır ve optimal curcumin konsantrasyonu 1-2 mikromolar dır. Çift seviyeli geri zekalı biyobelirteçler aynı doku üzerinde yapılabilir ve beyin hücrelerinin hangi tipte tesviye ediliyor daha büyük bir özgüllük sağlayabilir. Kurkuminaaplak plak yükünü azaltabildiği göz önüne alındığında, bu sürecin nasıl oluştuğuna dair kesin mekanizmalar şu anda hem hücresel hem de moleküler düzeyde araştırılmaktadır.
