Ce protocole est la méthode la plus efficace et la plus rentable pour étiqueter avec précision les plaques bêta-amyloïdes, par rapport aux anticorps spécifiques à l’amyloïde, qui sont actuellement l’étalon-or pour l’étiquetage de ces plaques. Cette technique prend moins de temps et est aussi efficace que n’importe quelle des méthodes d’étiquetage amyloïdes couramment utilisées. La curcumine se lie fortement aux plaques amyloïdes et peut être utilisée comme sonde d’imagerie lors de tep scans du cerveau et pour des dépistages relativement non invasifs à l’aide du balayage rétinien.
La curcumine se lie également à l’enchevêtrement neurofibrillaire ou tau dans la maladie d’Alzheimer, à l’alpha synucléine dans la maladie de Parkinson et aux protéines mutantes de Huntington dans la maladie de Huntington. Zackary Bowers, étudiant diplômé, et Alexandra Plemmons, chercheuse de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Panchanan Maiti. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de douleur chez une souris modèle anesthésiée de 12 mois de la maladie d’Alzheimer, placez la souris en position supine sur un plateau de chirurgie et faites une incision dans l’abdomen et par le diaphragme.
Insérez une aiguille de perfusion de calibre 21 dans l’incision et faites une petite incision à l’auricle droit pour permettre au liquide de perfusion de s’écouler du corps. Utilisez un système de perfusion alimenté par gravité pour permettre au fluide de PBS molaire de 0,1 molaire de s’écouler dans l’aiguille pendant cinq à six minutes à un débit de 20 à 25 millilitres par minute. Si la perfusion est effectuée correctement, un foie clair sera observé.
Une perfusion animale appropriée est essentielle parce que si le sang n’est pas enlevé complètement, la curcumine peut se lier aux vaisseaux sanguins et entraîner un signal vert de fond fluorescent. Lorsque tout le PBS a été livré, passez la valve tampon à une solution de paraformaldéhyde glacée de 4 % pendant huit à dix minutes avant d’utiliser des ciseaux et des forceps pour libérer le cerveau du crâne. Ensuite, utilisez une spatule pour placer le cerveau dans un flacon de 4% paraformaldéhyde au moins 10 fois le volume des tissus pour quatre degrés Celsius de stockage jusqu’au traitement.
Pour obtenir des sections pour la section cryostat, immerger séquentiellement le cerveau dans des solutions de saccharose classées à quatre degrés Celsius pendant 24 heures par concentration avant d’utiliser un cryostat à 22 degrés Celsius négatif pour obtenir 40 sections de micromètre, plaçant 10 à 20 sections par puits dans une plaque de six puits contenant PBS complétée par 0,02% azide comme ils sont obtenus. Lorsque tous les échantillons ont été acquis, entreposer les sections à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient traitées plus avant. Pour obtenir des sections pour la section de paraffine, déshydratez le tissu cérébral perfusé post-fixe avec des solutions séquentielles d’alcool classé pendant deux heures par concentration, suivi de deux immersions d’une heure 100% d’alcool et de deux immersions de xylène d’une heure à température ambiante.
Après la dernière immersion de xylène, pénétrer dans le tissu avec un xylène à paraffine solution deux fois pendant une heure par incubation à 56 degrés Celsius dans un verre conique en verre recouvert de papier d’aluminium avant d’immerger les tissus dans 56 degrés Celsius paraffine pendant quatre à six heures. À la fin de l’incubation, utilisez un microtome rotatif à température ambiante pour obtenir cinq sections micromètres d’épaisseur plaçant les sections dans un bain d’eau tissulaire de 45 degrés Celsius au fur et à mesure qu’elles sont recueillies. Pour l’étiquetage de la curcumine des plaques bêta amyloïdes dans les sections de tissu cryostatique, rincer les sections avec PBS trois fois pendant cinq minutes par lavage avant d’immerger les sections dans 70% d’éthanol pendant deux minutes à température ambiante.
Pendant que les sections couvent, dissoudre un millimolaire de curcumine de stock dans le méthanol et diluer la solution à une concentration de travail finale de 10 micromolaires avec 70% d’éthanol. À la fin de l’incubation, plonger les sections dans la solution de curcumine de travail pendant 10 minutes à température ambiante à 50 rotations par minute. À la fin de la période de coloration, jeter la solution de curcumine et laver les sections avec trois lavages de deux minutes dans 70% d’éthanol.
Après le dernier lavage, transférez les sections sur des glissières en verre enduit de polylysine et montez un slip de couverture sur chaque glissière avec un support organique approprié. Ensuite, visualisez les sections sur un microscope à florescence à l’aide d’un objectif de 10 ou 20 x et des filtres d’excitation et d’émission appropriés. Pour l’étiquetage histochimique des sections profondes de tissu paraffinized, immerger les cinq sections épaisses de micromètre dans le xylène deux fois pendant cinq minutes à la température ambiante par immersion, suivie de la réhydratation avec des immersions classées de solution d’alcool d’une minute.
À la fin de l’incubation, laver les sections avec des solutions d’alcool classées pendant deux minutes par concentration, puis les défricher avec deux immersions de xylène de cinq minutes. Après la deuxième immersion de xylène, montez chaque section sur une glissière de microscope avec un glissement de couverture et un support approprié de montage pour l’imagerie par microscopie de florescence comme démontré. Pour l’étiquetage des spécimens de section cryostat avec des anticorps anti-bêta A, lavez les échantillons trois fois avec du PBS frais par lavage dans les puits individuels d’une plaque de puits de 12 avant de bloquer toute liaison non spécifique avec 10% sérum de chèvre normal dans PBS et 0,5% triton x-100 pendant une heure à température ambiante.
À la fin de l’incubation, jetez la solution de blocage et incubez les échantillons avec un anticorps spécifique à une bêta pendant la nuit à quatre degrés Celsius et 150 rotations par minute. Le lendemain matin, laver les sections avec trois lavages de 10 minutes en PBS frais par lavage, suivi de l’incubation avec un anticorps secondaire approprié conjugué à un fluorophore rouge pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les sections trois fois avec du PBS suivie d’un lavage avec 70 % d’alcool.
Après le lavage à l’alcool, incuber les sections avec 10 curcumine micromolaire pendant 10 minutes à température ambiante suivie de trois lavages d’une minute 70% d’alcool. Après le dernier lavage, déshydrater les sections avec 90% et 100% d’alcool pendant une minute par concentration et effacer les sections deux fois pendant cinq minutes par immersion avec du xylène frais par incubation. Puis monter et l’image des sections comme démontré.
Pour la co-localisation bêta amyloïde intracellulaire, tacher les sections avec anticorps bêta anti-amyloïde suivie de taches avec de la curcumine à température ambiante et 50 rotations par minute protégées de la lumière comme démontré. À la fin de l’incubation, contrestain avec un colorant nucléaire approprié pendant 10 minutes à température ambiante et 50 rotations par minute à l’abri de la lumière suivie de trois lavages en PBS. Montez et imagez ensuite les sections par microscopie de fluorescence comme démontré.
Bien que l’augmentation du temps d’incubation avec la curcumine augmente légèrement l’intensité de fluorescence des plaques bêta A, le nombre de plaques observées n’est pas significativement différent entre une et cinq minutes de temps de coloration. La curcumine peut être utilisée pour tacher les plaques bêta A et les échantillons de tissus cryosectionés, paraffine intégrées et humains de la maladie d’Alzheimer. L’étiquetage avec un anticorps spécifique à la bêta avant la coloration de la curcumine révèle que la curcumine est complètement co-localisée avec une bêta aux mêmes plaques qui lient l’anticorps.
Après coloration avec la curcumine étiquetée A oligomers bêta, la co-localisation de curcumine avec les oligomers peut être observée dans les plaques bêta A. De même, la curcumine co-localise également avec l’anticorps spécifique à la bêta A dans les espaces intracellulaires, confirmant que la tache peut étiqueter la bêta intracellulaire A. L’étiquetage de la curcumine est également plus important que les dyes de fixation amyloïdes conventionnelles.
Les dérivés de la curcumine trouvés dans les extraits tumériques étiquettent les plaques bêta A comparativement à la curcumine dans le tissu cérébral humain de la maladie d’Alzheimer indépendamment du type de milieu de montage utilisé. En outre, les signaux d’immunofluorescence de curcumine et l’intensité de contre-coloration sont maintenus même après coloration avec les taches nucléaires typiques et d’autres marqueurs cellulaires. Nous avons rencontré que les sections constantes devraient être plus minces que 40 microns.
Cette procédure de formation doit être maintenue en dessous de 30 minutes et la concentration optimale de curcumine est d’un à deux micromolaires. Les biomarqueurs retardés à double nivellement peuvent être effectués sur le même tissu et peuvent fournir une plus grande spécificité des types de cellules cérébrales qui sont nivelés. Étant donné que la curcumine peut réduire la charge de plaque amyloïde, les mécanismes précis de la façon dont ce processus se produit est actuellement à l’étude aux niveaux cellulaire et moléculaire.
