Этот протокол является наиболее эффективным и экономически эффективным методом точной маркировки бета-амилоидных бляшек, по сравнению с амилоидными антителами, которые в настоящее время являются золотым стандартом для маркировки этих бляшек. Этот метод занимает меньше времени и столь же эффективен, как и любой из широко используемых методов маркировки амилоидов. Куркумин сильно связывается с амилоидными бляшками и может быть использован в качестве зонда для визуализации во время ПЭТ-сканирования мозга и для относительно неинвазивных скринингов с помощью сканирования сетчатки.
Куркумин также связывается с нейрофибриллярией или тау клубок при болезни Альцгеймера, альфа-синуклеин при болезни Паркинсона, и мутант Хантингтон белков в болезни Генттона. Демонстрацией процедуры с Панчананом Маити будут Закари Бауэрс, аспирант, и Александра Племмонс, научный сотрудник из моей лаборатории. После подтверждения отсутствия реакции на болевой рефлекс в анестезии 12-месячной болезни Альцгеймера модели мыши, поместите мышь в положение на спине на подносе хирургии и сделать разрез в живот и через диафрагму.
Вставьте 21 калибровочных перфузии иглы в разрез и сделать небольшой разрез в правой ушной раковине, чтобы перфузиовневой жидкости для слива из тела. Используйте гравитационную систему перфузии, чтобы позволить ледяной жидкости 0,1 моляра PBS поступать в иглу в течение пяти-шести минут при скорости потока от 20 до 25 миллилитров в минуту. Если перфузия выполняется правильно, то будет наблюдаться чистая печень.
Правильная перфузия животных имеет важное значение, потому что если кровь не удаляется полностью, куркумин может связываться с кровеносными сосудами и привести к зеленому флуоресцентный фоновый сигнал. Когда все PBS был доставлен, переключить буферный клапан на ледяной 4%paraformaldehyde решение в течение восьми до 10 минут, прежде чем использовать ножницы и типсы, чтобы освободить мозг от черепа. Затем используйте шпатель, чтобы поместить мозг во флакон 4%paraformaldehyde по крайней мере в 10 раз объем ткани в течение четырех градусов по Цельсию хранения до обработки.
Для получения разделов для криостата секций, последовательно погрузить мозг в градуированных растворов сахарозы при четырех градусах по Цельсию в течение 24 часов за концентрацию, прежде чем использовать криостат при отрицательном 22 градусов по Цельсию, чтобы получить 40 микрометровых секций, размещение от 10 до 20 секций на колодец в шесть пластин, содержащих PBS дополняется 0,02% азида, как они получены. Когда все образцы были приобретены, хранить разделы на четыре градуса по Цельсию до дальнейшей обработки. Для получения разделов для парафина секций, обезвоживают пост-фиксированной perfused ткани мозга с последовательными градуированных алкогольных растворов в течение двух часов на концентрацию, а затем два один час 100% погружения алкоголя и два одного часа погружения ксилена при комнатной температуре.
После последнего погружения ксилена, проникнуть в ткань с один к одному ксилену парафин раствор два раза в течение одного часа на инкубацию при 56 градусов по Цельсию в стеклянном коническом стекле, покрытом алюминиевой фольгой, прежде чем погрузить ткани в 56 градусов по Цельсию парафин в течение четырех-шести часов. В конце инкубации используйте роторный микротом при комнатной температуре, чтобы получить пять секций толщиной в пять микрометров, помещая секции в водяную баню ткани 45 градусов по Цельсию по мере их сбора. Для маркировки куркумина амилоидных бета-бляшек в секциях криостатической ткани, промыть секции с PBS три раза в течение пяти минут за стирку перед погружением разделов в 70% этанола в течение двух минут при комнатной температуре.
В то время как секции инкубируются, растворите один миллимолярн бульонного куркумина в метаноле и разбавьте раствор до конечной рабочей концентрации 10 микромолей с 70% этанола. В конце инкубации погрузите секции в рабочий раствор куркумина на 10 минут при комнатной температуре при 50 вращениях в минуту. В конце периода окрашивания, отказаться от раствора куркумин и мыть секции с тремя две минуты моет в 70%этанола.
После последней стирки перенесите секции на полилинированные стеклянные горки и смонтировать крышку скольжения на каждой слайд с соответствующей органической среды монтажа. Затем просмотрите разделы на флуоресцентный микроскоп с помощью 10 или 20x цели и соответствующие возбуждения и выбросов фильтров. Для гистохимической маркировки глубоких парафинизированных секций тканей, погрузите пять микрометров толщиной секций в ксилен два раза в течение пяти минут при комнатной температуре за погружение, а затем регидратации с градуированных одну минуту погружения раствор алкоголя.
В конце инкубации промыть секции градуированными спиртовыми растворами в течение двух минут на концентрацию с последующим очисткой с двумя пятиминутными погружениями ксилена. После второго погружения ксилена, смонтировать каждый раздел на слайде микроскопа с крышкой скольжения и соответствующие монтажные среды для флуоресценции микроскопии изображения, как попродемонстрировано. Для маркировки образцов криостата с анти-бета-антителами, мыть образцы три раза со свежим PBS на стирку в отдельных скважинах 12 хорошо пластины, прежде чем блокировать любые неспецифические связывания с 10%нормальной сыворотки козы в PBS и 0,5%triton x-100 в течение одного часа при комнатной температуре.
В конце инкубации отбросьте блокирующий раствор и инкубировать образцы бета-специфическим антителом на ночь при четырех градусах Цельсия и 150 вращениях в минуту. На следующее утро, мыть разделы с тремя 10 минут моет в свежем PBS за стирку, а затем инкубации с соответствующим вторичным антителом конъюгированных с красным флюорофором в течение одного часа при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации, мыть разделы три раза с PBS следуют одна стирка с 70% алкоголя.
После мытья алкоголя, инкубировать разделы с 10 микромоляных куркумин в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем три одну минуту 70% алкоголя моет. После последней стирки обезвоживаем секции 90%и 100% алкоголем в течение одной минуты за концентрацию и очищаем секции два раза в течение пяти минут за погружение свежим ксиленом на инкубацию. Затем смонтировать и изображение разделов, как попродемонстрировано.
Для внутриклеточной бета-локализации амилоидной бета-локализации, пятно разделов с анти амилоидных бета-антител, а затем окрашивание куркумин при комнатной температуре и 50 вращений в минуту защищены от света, как попродемонстрировано. В конце инкубации счетчики с соответствующим ядерным красителем в течение 10 минут при комнатной температуре и 50 вращений в минуту защищены от света, а затем три моет в PBS. Затем крепление и изображение секций с помощью микроскопии флуоресценции, как попродемонстрировано.
Хотя увеличение инкубации время с куркумином немного увеличивает интенсивность флуоресценции бета бляшек, количество наблюдаемых бляшек не значительно отличается между одной и пяти минут окрашивания времени. Куркумин может быть использован для испачка бета бляшек и криозекции, парафин встроенных, и образцы тканей болезни Альцгеймера человека. Маркировка с бета специфическим антителом перед окрашивание куркумина показывает, что куркумин полностью локализован бета на тех же бляшках, которые связывают антитела.
После окрашивания куркумином помечены бета-олигомеры, куркумин совместной локализации с олигомерами можно наблюдать в бета бляшки. Аналогичным образом, куркумин также со-локализуется с бета-специфического антитела во внутриклеточных пространствах, подтверждая, что пятно может обозначить внутриклеточной бета-версии. Куркумин маркировки также более заметным, чем обычные амилоидные связывающие красители.
Производные куркумина, найденные в тумерических экстрактах этикетки бета бляшки сравнительно куркумин в ткани мозга болезни Альцгеймера человека, независимо от типа монтажа среды используется. Кроме того, сигналы иммунофлуоресценции куркумина и интенсивность противоутовки поддерживаются даже после окрашивания типичными ядерными пятнами и другими клеточными маркерами. Мы встретились, что постоянные секции должны быть тоньше, чем 40 микрон.
Эта процедура обучения должна храниться под 30 минут и оптимальной концентрации куркумин от одного до двух микромоляров. Двойное выравнивание отсталых биомаркеров может быть выполнено на той же ткани и может обеспечить большую специфичность, какие типы клеток мозга выравниваются. Учитывая, что куркумин может уменьшить нагрузку амилоидных бляшек, точные механизмы, как этот процесс происходит в настоящее время изучается как на клеточном и молекулярном уровнях.
