Dieses Protokoll zeigt eine Mikrotextur-Zellkulturschale, die für das Wachstum von Hunderten von Organoiden mit Materialkenntnissen entwickelt wurde und vollständig mit der Mikroskopie kompatibel ist. Unsere Technik ermöglicht es, Tausende von Organoiden effizient zu erzeugen, die vollständig mit Langzeitbildgebung und Langzeitzellkultur kompatibel sind. Dieses Protokoll ist von großem Interesse für biomedizinische Anwendungen wie die Screening-Pipeline von Medikamenten und die Krebsforschung.
Die Technik, die in diesem Protokoll vorgestellt wird, ist nach einigen Versuchen von jedem, der Erfahrung mit Laborverfahren und optischer Mikroskopie hat, leicht zu beherrschen. Schneiden Sie zunächst kleine Teile der PDMS-Form auf die für das endgültige Gerät erforderliche Größe zu. Schneiden Sie sie parallel zu den XY-Richtungen des Arrays.
Legen Sie einen der vorbereiteten PDMS-Formwürfel mit der Vorderseite nach unten auf den flachen PDMS-Abschnitt. Fügen Sie dann mit einer Pipette etwa 0,1 bis 0,2 Milliliter UV-härtenden Klebstoff auf eine Seite der Form auf. Verfolgen Sie den Verlauf der Flüssigkeit im Inneren des Hohlraums mit einem inversen Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
Setzen Sie den Klebstoff UV-Licht aus, um ihn auszuhärten. Passen Sie die Belichtungszeit in Abhängigkeit von der Leistungsdichte der UV-Quelle an, wie im Textmanuskript beschrieben. Halten Sie den ausgehärteten Klebstoff mit der überschüssigen Klebstoffmenge an einer Kante auf dem flachen PDMS-Substrat, indem Sie ihn vorsichtig mit einem Finger drücken.
In der Zwischenzeit drücken Sie mit einer Pinzette eine Ecke der Form neben der gleichen Kante, die gedrückt wird, und ziehen Sie die Form langsam ab, während Sie sicherstellen, dass der strukturierte Film nicht angehoben wird. Schneiden Sie den überschüssigen Klebstoff und das PDMS-Substrat mit einer Rasierklinge ab, um die ausgehärtete, strukturierte und adhäsive Schicht flach auf dem PDMS zu belassen, wobei sich das überschüssige Substrat nur auf einer Kante befindet. Behandeln Sie ein sauberes Deckglas mit einem kurzen Sauerstoffplasmaprozess, um seine Hydrophilie zu verbessern.
Nach der Plasmaaktivierung beschichten Sie die dünne Schicht des UV-härtenden Klebstoffs, indem Sie das Deckglas auf das Vakuumspannfutter eines Standard-Spin-Coaters legen und einen kleinen Tropfen Klebstoff in die Mitte des Deckglases gießen. Führen Sie den Schleuderbeschichtungsprozess wie im Textmanuskript beschrieben durch. Wenn keine Schleuderbeschichtung verfügbar ist, geben Sie mit einer Pipette etwa 0,1 Milliliter UV-härtenden Klebstoff auf ein sauberes Deckglas.
Nehmen Sie ein zweites Deckglas und legen Sie es auf das erste, damit sich der flüssige Klebstoff gleichmäßig zwischen den beiden Deckgläsern verteilt. Sobald der Klebstoff den Rand der Deckgläser erreicht hat, trennen Sie sie vorsichtig, indem Sie sie übereinander schieben. Nach dem Trennen werden beide Deckgläser vollständig mit einer dünnen Schicht Flüssigkleber überzogen.
Nach dem Schleudern härten Sie den Klebstoff unter UV-Einwirkung vor. Passen Sie die Belichtungszeit in Abhängigkeit von der Leistungsdichte der verwendeten UV-Quelle an. Nehmen Sie eine der strukturierten Folien und bringen Sie sie in Kontakt mit dem selbstklebenden, beschichteten Deckglas. Achten Sie darauf, dass der Kontakt zwischen dem teilausgehärteten Klebstoff und der strukturierten Folie so gleichmäßig wie möglich ist.
In diesem Stadium sollte der Klebstoff auf dem Deckglas fest genug sein, um ein Wiederfließen zu vermeiden, und der Kontakt kann durch vorsichtiges Drücken auf das Deckglas optimiert werden. Setzen Sie die Deckgläser UV-Licht aus, bis die beschichtete Klebeschicht vollständig ausgehärtet ist. Dadurch wird die strukturierte Folie auf dem Deckglas versiegelt und eine auslaufsichere Isolierung zwischen den Perimeterhohlräumen gewährleistet.
Drücken Sie dann mit einer Pinzette das PDMS an der Kante zusammen, an der das überschüssige Material nach dem Trimmen zurückgeblieben ist, und ziehen Sie das flache PDMS-Substrat ab. Dieser Schritt ermöglicht es, dass die texturierte Filmschicht auf dem Deckglas haftet, mit offenem Zugang an der Oberseite für die Zellaussaat. Vor der Zellaussaat wird auf einem mit biometrischem Copolymer passivierten Gerät, wie im Manuskript beschrieben, ein Milliliter steriles PBS in die 35-Millimeter-Zellkultur-Petrischalen gegeben.
Entgasen Sie die Schale mit sterilem PBS in der Vakuumkammer für 10 Minuten, gefolgt von mehreren Pipettierrunden, um alle Blasen zu entfernen. Ersetzen Sie das PBS durch steriles Kulturmedium und sterilisieren Sie die Platte mit UV-Licht für 30 Minuten unter einer Zellkulturhaube. Bereiten Sie eine Zellsuspension vor, indem Sie die Empfehlungen zur Trypsinisierung oder Zellsuspensionsvorbereitung für die interessierenden Zellen befolgen, wie im Textmanuskript beschrieben.
Zählen und stellen Sie die Zellkonzentration auf 500.000 Zellen pro Milliliter im empfohlenen Zellkulturmedium ein. Entfernen Sie den PBS-Puffer aus der 35-Millimeter-Zellkulturschale und geben Sie anschließend einen Milliliter der eingestellten Zellsuspension ab. Legen Sie die Zellkulturschale für 10 Minuten zurück in den Zellinkubator.
Ungefähr 80 bis 100 Zellen treten in jeden Perimeterhohlraum ein. Nach ca. 10 Minuten Inkubation die Zellkulturschale aus dem Inkubator entnehmen und die Zellsuspension vorsichtig absaugen, um nicht eingeschlossene Zellen zu entfernen. Geben Sie einen Milliliter Kulturmedium in die Kulturschale und legen Sie sie zurück in den Zellinkubator.
Um die Organoide zu gewinnen, nachdem sie in den Vertiefungen gewachsen sind, klemmen Sie die strukturierte Klebeschicht mit einer Pinzette auf die Schnittkante und ziehen Sie sie vorsichtig vom Glasdeckglas ab, lassen Sie sie jedoch in das Medium eingetaucht. Die Erhöhung der Konzentration von biometrischem Copolymer erhöhte die Schichtdicke. Eine vollständige Entgasung der Zellkulturschalen war unerlässlich, um die in den Umfassungshohlräumen eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.
Organoide wurden nach dem zweiten und 15. Tag der Kultivierung gebildet. Die konfokale Spinning-Disc-Mikroskopie zeigte repräsentative Bilder der Organoide und eine 3D-Rekonstruktion. Bei der Zubereitung der Kulturschale ist es wichtig, auf die Montage der Form oder des Substratstapels zu achten und auf einen guten Kontakt zwischen der strukturierten Folie und dem Deckglas zu achten.
Die Eindämmung durch unsere Mikrohohlräume und das Fehlen von Materialverlust hat die Aufmerksamkeit von Weltraumbiologieforschern auf sich gezogen, die daran interessiert sind, die Wirkung der Schwerelosigkeit auf die homöostase von Organoiden zu untersuchen.
