Dieses Protokoll demonstriert die mechanische Störung von Meereseleganen. In einem 96-Well-Format, das eine Quantifizierung der Bakterienbelastung in einzelnen Würmern mit mittlerem Durchsatz ermöglicht. Diese Technik erhöht die Geschwindigkeit und Gleichmäßigkeit der mechanischen Disruption im Vergleich zu Pasel-basierten Methoden, so dass Forscher leicht größere Datensätze von qualitativ hochwertigen Einzelwurmmessungen erstellen können.
Diese Technik beinhaltet viele bewegliche Teile und es ist leicht, Ihren Platz zu verlieren. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Materialien, beschrifteten Rohre, Puffer und Platten eingerichtet haben, bevor Sie beginnen. Megan Taylor, eine Forschungsspezialistin aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.
Beginnen Sie mit der Resuspendierung der Schneckenprobe in einem Milliliter M neun TX Null eins in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die erwachsenen Würmer durch Zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand. Mit den gleichen Zentrifugationsparametern.
Spülen Sie die Würmer zweimal mit einem Milliliter M9TX01 und einmal mit einem Milliliter M9-Wurmpuffer, um die externen Bakterien zu minimieren. Anschließend wird jede Probe in einem Milliliter S-Medium plus zwei x wärmeabgetötetem OP50 in einem Kulturröhrchen resuspendiert. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 25 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten, um die nicht adhaftierten Bakterien aus dem Darm zu passieren.
Nach der Inkubation spülen Sie die gereinigten Würmer zweimal mit einem Milliliter kaltem M9TX01 ab und entsorgen Sie den Supernatant. Legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten auf Eis, um die Würmer zu lähmen. Dann fügen Sie jedem Röhrchen einen Milliliter eiskalten Mnine-Wurmpuffer mit unparfümiertem Bleichmittel hinzu.
Inkubieren Sie die Röhrchen mindestens 10 Minuten auf Eis, um externe Bakterien abzutöten. Entsorgen Sie den Bleichmittelpuffer und bringen Sie die Röhrchen zurück ins Eis, um zu verhindern, dass die Würmer pumpen. Als nächstes fügen Sie jedem Röhrchen einen Milliliter kaltes M9TX01 hinzu und zentrifugieren Sie fünf Sekunden lang.
In einer Minizentrifuge. Bringen Sie die Röhrchen wieder auf Eis und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
Zur chemischen Permeabilisierung der Wurmkutikula. Die Röhrchen mit den Würmern werden in 20 Mikrolitern Puffer in ein Raumtemperatur-Rohrgestell überführt. Dann fügen Sie 100 Mikroliter SDS / DTT-Lösung zu jeder warmen Probe hinzu.
Inkubieren Sie die Röhrchen für bis zu acht Minuten auf der Bank, um die Nagelhaut der erwachsenen Würmer teilweise abzubauen. An diesem Punkt sterben die Würmer und setzen sich am Boden der Röhre ab. Nach der Inkubation den SDS/DTT-Überstand vorsichtig verwerfen.
Dann fügen Sie einen Milliliter M9TX01 zu jedem Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie kurz, um die Würmer zu pelletieren. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Würmer in einem Milliliter Mneun-Wurmpuffer mit 0,1% Triton x-100. Um sich auf das mechanische Brechen von Würmern vorzubereiten, erhalten Sie eine sterile zwei Milliliter tiefe 96-Well-Platte und eine Silikonplattenabdeckung.
Verwenden Sie einen sterilen Schaufelspatel, um eine kleine Menge steriles 36-Gitter-Silikonkarbid in jede Vertiefung zu geben, so dass das Gitter den Boden des Lochs kaum bedeckt. Fügen Sie jedem Bohrloch 180 Mikroliter Mnine-Wurmpuffer hinzu. Beschriften Sie die Spalten und Reihen und bedecken Sie die Platte dann locker mit der Silikonplattenabdeckung.
Als nächstes übertragen Sie die permeabilisierten Würmer in eine kleine Petrischale mit M9TX01, die bis zu einer Tiefe von einem Zentimeter gefüllt ist. Mit einem Seziermikroskop pipetten Sie einzelne Würmer in 20 Mikrolitern Volumen heraus und übertragen sie in einzelne Vertiefungen der 96-Well-Platte, um alle an der Pipette haften Würmer auszuwerfen, saugen Sie 20 Mikroliter M9TX01 aus einem freien Bereich der Petrischale ab und geben Sie sie wieder in die Schale ab. Sobald alle Würmer übertragen sind, bedecken Sie die 96-Well-Platte mit einem Blatt flexibler Deckenfolie, wobei die papiergestützte Seite nach unten auf die Probenmulden zeigt.
Legen Sie die Silikon-Deckenmatte leicht auf die flexible Deckenfolie, ohne die Abdeckung in die Vertiefungen zu drücken. Stellen Sie die Platte für 30 bis 60 Minuten auf vier Grad Celsius, um eine Überhitzung während der Störung zu vermeiden. Nach dem Abkühlen der Platte drücken Sie die Silikondeckenmatte fest in die Vertiefungen, um sie abzudichten.
Dann sichern Sie die Platten im Gewebedisruptor. Schütteln Sie die Platten eine Minute lang bei 30 Hertz. Drehen Sie dann die Platten um 180 Grad und wiederholen Sie das Schütteln für eine Minute.
Klopfen Sie die Platten zwei- oder dreimal fest auf die Bank, um den Splitt von der flexiblen Deckenfolie zu lösen. Zentrifugieren Sie das Plattenset 2, 400 mal G für zwei Minuten, um die Proben am Boden der Vertiefungen zu sammeln. Entfernen Sie dann den Silikondeckel und ziehen Sie die Deckenfolie ab.
Um eine zehnfache serielle Verdünnung der Schneckenaufschlüsse vorzubereiten, füllen Sie 180 Mikroliter eines X PBS in die Reihen B bis D einer 96-Well-Platte. Mischen Sie den Wurmverdau mit einem auf 200 Mikroliter eingestellten Multiwell-Pipetter langsam durch Pipettieren. Übertragen Sie die maximale Menge der Flüssigkeit in Reihe A der 96-Well-Platte, die PBS enthält.
Mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter aus der oberen Reihe entnehmen und in Reihe B dosieren.Anschließend mischen. Wiederholen Sie diesen Schritt für Zeile B bis C und dann Reihe C bis D, um eine 1000-fache Verdünnung für die bakterielle Quantifizierung von monokolonisierten Würmern zu erhalten. Platte 10 bis 20 Mikroliter jeder Verdünnung auf festen Agarplatten.
Für die Multispezies-Besiedlung 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf 10 Zentimeter Agarplatten ansiedeln. Unter Verwendung dieses Protokolls wurde eine wirksame externe Desinfektion nach der Oberflächenbleiche von kältegelähmten Würmern beobachtet, wie der Rückgang externer Bakterien im Puffer zeigt. Ohne die Darmbakterien zu beeinflussen.
Die manuelle Störung von Würmern führte zu mehr Heterogenität. Silikonkarbid-Körnung war ideal für Disruption mit oder ohne Tri Andex. Bei der 96-Well-Methode waren große Glasperlen für die 96-Well-Technik nicht geeignet.
Kleine Glasperlen lieferten konsistente Ergebnisse, verstopften aber das Rohr an der Spitze. Würmer, die auf demselben Bakterienpool besiedelt waren, zeigten eine hohe Variation der Darmbelastung, wenn sie für einzelne Bakterien und Multispezies-Bakteriengemeinschaften beobachtet wurden. Würmer, die mit Bakterien besiedelt waren, die GFP exprimieren, zeigten Heterogenität in einzelnen Wurmmessungen.
Für diesen GFP-exprimierenden Bakterienstamm vergleicht man die Besiedlung des Wildtyps Bristol Len mit zwei Würmern. Zu DAF zeigten zwei IGF-Mutanten, dass die DAF 16-Mutante größere Bakterienpopulationen unterstützt, während DAF zwei resistent gegen Besiedlung ist. Diese Heterogenität war charakteristisch und konsistent über verschiedene Durchläufe desselben Experiments.
Es wurde festgestellt, dass eine erneute Stichprobe von Daten zur Simulation von Batch-Aufschlüssen die Verteilung im Vergleich zu einzelnen Wurmdaten verändert. Die chargenextrapolierte KBE pro Wurm war um das arithmetische Mittel der einzelnen Daten zentriert, was zum Verlust der biologischen Variation führte. Anstatt mit der Verdauung von lebenden Oberflächenbleich- und Spülwürmern fortzufahren, können sie für weitere Experimente verwendet werden.
Die Bewegung wird schnell wieder aufgenommen, sobald die Würmer aus der Kälte entfernt sind.
