Durch die genetische Kennzeichnung einzelner Zellen mit fluoreszierenden Proteinen und die Anschließende hat die Konfettimaus Forschern neue Erkenntnisse über viele biologische Prozesse ermöglicht. Unser Protokoll minimiert Verzögerungszeiten zwischen Gewebesammlung und Bildgebung, kann auf jedes mineralisierte oder nichtmineralisierte Gewebe angewendet werden und bewahrt die Fluoreszenz für mehrere Jahre. Diese Methode ist sehr nützlich für alle Bereiche der regenerativen Medizin und Entwicklungsbiologie, da sie auf verschiedene Zellpopulationen angewendet werden kann, um ihr Schicksal und ihre Kinetik zu untersuchen, solange eine geeignete Cre-Linie zur Verfügung steht.
Unsere Schritt-für-Schritt-Anleitung zeigt den schwierigsten Schritt, um die Differenz der fluoreszierenden Signale zu unterscheiden, die von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen emittiert werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Mausgewebes für die Bildgebung. Für Weichteile und mineralisierte Tibiae und Femora von Mäusen bis 45 Tage alt, fixieren Sie das Gewebe in vorgekühlten 3,7%Formaldehyd PBS und inkubieren Sie es bei 4 Grad Celsius für sechs Stunden, während es sanft auf einem Rotator rollt.
Für mineralisierte Gewebe wie Tibiae und Femora von Mäusen über 45 Tage, bereiten Sie einen Liter von 10%EDTA-Lösung mit dem pH-Wert auf 8,05 mit Natriumhydroxid eingestellt und verdünnen Sie das Formaldehyd auf 3,7%mit dieser Lösung. Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie es in 3,7% Formaldehyd PBS über Nacht bei 4 Grad Celsius halten. Legen Sie es am nächsten Tag in die vorgekühlte Formaldehyd-EDTA-Lösung und inkubieren Sie es bei 4 Grad Celsius, während Sie 48 Stunden rotieren, wobei Sie sicherstellen, dass die Lösung während der Inkubation dreimal ersetzt wird.
Dann legen Sie das Gewebe in vorgekühlte 30%Saccharose, stellen Sie sicher, den Behälter bis zum Rand zu füllen, und drehen Sie es vorsichtig über Nacht bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie am Morgen Zangen, um das Gewebe aus der Saccharoselösung zu entfernen und es für ein paar Sekunden in fünf Milliliter optimaler Schnitttemperaturverbindung oder OCT zu spülen. Füllen Sie einen vorbeschrifteten Kryomold mit OCT und positionieren Sie das Gewebe an der Unterseite, so dass schnell arbeiten, um zu lange das Sitzen der Probe bei Raumtemperatur zu vermeiden.
Die Probe einbetten, indem Sie die Form auf Trockeneis legen und darauf warten, dass das OCT erstarrt. Wenn die Proben nicht sofort verwendet werden, können sie bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Entfernen Sie den Block aus der Form.
OCT zwischen der Oberseite des Blocks und dem Futter auftragen und im Kryostat mindestens fünf Minuten abkühlen oder bis das OCT vollständig erstarrt ist. Den Probenhalter und den Klingenhalter auf minus 20 Grad Celsius vorkühlen, dann die Probe in den Futterhalter und die Klinge in den Klingenhalter legen und einige Minuten ausbalancieren lassen. Für die postnatale Wachstumsplattenanalyse bereiten Sie Abschnitte vor, die 30 bis 160 Mikrometer betragen.
Verwenden Sie den Kryostat, um den Block zu trimmen und Gewebeabschnitte auf eine geeignete Dicke zu schneiden und sie auf Dias zu sammeln. Dann trocknen die Dias bei Raumtemperatur bis sie vollständig trocken und lagern sie bis zu 36 Monate bei minus 20 Grad Celsius. Wenn Sie bereit sind, die Folie zu verwenden, entfernen Sie sie aus dem Gefrierschrank und bringen Sie sie auf Raumtemperatur in einem Schiebehalter.
Um das OCT zu entfernen, tragen Sie PBS vorsichtig mit der Pasteur-Pipette auf den Schlitten auf. Für 160 Mikrometer dicke Abschnitte, inkubieren Sie die Rutsche für 15 Minuten, entfernen Sie die Flüssigkeit und wenden Sie frische PBS für fünf weitere Minuten. Montieren Sie die Dias in einer Lösung von 75%Thiodiethanol bei Raumtemperatur mit 60 Millimeter langen Deckrutschen.
Wählen Sie zunächst den RFP-Kanal aus, indem Sie auf der Registerkarte Kanäle darauf klicken, wodurch die Details des Kanals auf der Registerkarte Lichtpfad angezeigt werden. Klicken Sie dann auf das Kontrollkästchen neben T-PMT. Platzieren Sie die Folie in den Schiebehalter und positionieren Sie das von Interesse sindde Gewebe direkt zwischen dem Lichtpfad und der Objektivlinse.
Um das Gewebe zu lokalisieren, deaktivieren Sie die Felder YFP und CFP unter der Spurüberschrift der Registerkarte Kanäle. Wählen Sie den T-PMT-Kanal in der Überschrift der Spuren aus, klicken Sie dann live in der Erfassungsregisterkarte und erhöhen Sie die Verstärkung für den T-PMT-Kanal, um die Gewebeauswahl auf dem Bildschirm zu visualisieren. Passen Sie die Position des Dias an, um den Interessenbereich zu lokalisieren und mit dem entsprechenden Mikroskopknopf zu fokussieren.
Klicken Sie dann auf Stopp in der Erfassungsregisterkarte, um die Laserbelichtung auszuschalten. Definieren Sie bildgebende Parameter gemäß den Manuskriptanweisungen und passen Sie ggf. die Lochgröße an. Überprüfen Sie das Setup, um sicherzustellen, dass sich die aufgezeichneten Signale nicht überlappen, wählen Sie dann alle drei Kanäle in der Registerkarte Kanäle aus und drücken Sie die Drucktaste.
Scrollen Sie zwischen den Anzeigekanälen im resultierenden Bild, indem Sie auf die blau hervorgehobenen Felder über jedem Kanal auf der Registerkarte Dimensionen klicken, und überprüfen Sie manuell, ob sich die Kanäle auf dem Bildschirm überlappen. Wenn sich die Signale überlappen, stellen Sie die Parameter nach, bis sie voneinander unterschieden werden können. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Chondrozyten im epiphysealen Knorpel zu beschriften und ihre klonale Expansion mit dem Alter zu visualisieren.
Der mittelgroße Abschnitt wurde durch Visualisierung des Kreuzbandes bestimmt und Klone in der proximalen tibialen Wachstumsplatte wurden abgebildet. Einzelne Zellen, die Col2 positiv waren und bei Dertoxifen-Verabreichung mit Konfetti-Fluoreszenzproteinen gekennzeichnet wurden, wurden klonal erweitert und blieben anschließend in der Wachstumsplatte. Das Fluoreszenzsignal kann nach Langzeitspeicherung visualisiert werden.
Einige Abschnitte wurden über drei Jahre vor der Vorbereitung und Bildgebung gelagert. Die dreidimensionale Rekonstruktion wurde automatisch mit Bildanalysesoftware durchgeführt und als Video exportiert. Ein Abschnitt, der während des Kryosektionsschritts unterbrochen wurde, enthält einen Bereich mit einem so hohen Rekombinationsgrad, dass er eine klonale Analyse verhindern würde, was eines der häufigsten Probleme dieses Protokolls demonstriert.
Je nach Forschungsfrage kann die Verwendung einer Cre-Linie, die Ihre Zellen speziell als interessant kennzeichnet, sehr wichtig sein. Daher empfehlen wir, die Fluoreszenz in diesen Zellen kurz nach der Rekombination zu überprüfen. Die Verwendung induzierbarer Cre-Linien ist wichtig, da eine fortlaufende DNA-Rekombination in nicht induzierbaren Cre-Linien das fluoreszierende Profil der gelutten Zellen verändern kann und somit eine klonale Analyse ausschließt.
Dieses Protokoll kann mit funktionellen Störungen wie genetisch manipulierten Stämmen, pharmakologischen Behandlungen, chirurgischen Eingriffen sowie Immunfluoreszenzfärbung enpariert werden.
