Wir sind dankbar für Dr. Xinyu Li Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. SW wurde von einem Startup-Fonds von der Tulane University, Präsident des Forschungsrates New Investigator Award vom UT Southwestern Medical Center, NIH EY021862, einer Karriereentwicklung Auszeichnung von der Forschung zur Blindheit Fundament verhindern, und eine helle Focus Award in altersbedingte Makuladegeneration Forschung unterstützt .

Hinweis: Das folgende Protokoll und repräsentative Ergebnisse verwenden Sie den HDAC-Inhibitor SAHA als Beispiel Verbindung. Jedoch ist dieses Protokoll keineswegs auf die Verwendung von SAHA beschränkt und wird als allgemeines Verfahren, um die Wirkungen von löslichen Verbindungen auf corneale Neovaskularisierung zu testen empfohlen. Geringfügige Änderungen müssen für Verdünnungsgrad sowie Häufigkeit und Dauer der Anwendung vorgenommen werden. Darüber hinaus werden Verbindungen, die in Wasser leicht löslich sind, in der Lage, in Abwesenheit von DMSO verabreicht werden. Ethische Erklärung: Alle Tierversuche sollten nur in Übereinstimmung mit dem nationalen Recht und institutionelle Bestimmungen durchgeführt werden. Dieses Protokoll wurde für die Nutzung durch Tulane University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Herstellung von Materialien (in der Reihenfolge der Verwendung) <ol><li> Schneiden Sie ein Stück von Cellulose-Filterpapier (11 um) in 2 mm Kreisen. </li><li> Vorbereitung einer 1 M Lösung von NaOH durchAuflösen von 20 g NaOH in 500 ml destilliertem H 2 O. Lagern bei Raumtemperatur. ACHTUNG: NaOH-Lösungen sind ätzend und kann alkali Verbrennungen verursachen. </li><li> Vorbereitung eines Narkose Cocktail durch Verdünnen von 10 ml 100 mg / ml Ketamin und 2,5 ml 20 mg / ml Xylazin in 37,5 ml 1x PBS zu einer Endkonzentration von 20 mg / ml Ketamin und 4 mg / ml Xylazin. </li><li> Vorbereitung einer 0,5% igen Lösung von Proparacain-Hydrochlorid (für die topische Analgetika) durch Auflösen von 500 mg Proparacain-Hydrochlorid in 100 ml PBS filtriert. </li><li> Vorbereitung 1x PBS durch Lösen von 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,23 g NaH 2 PO 4 in 900 ml destilliertem H 2 O. Passen auf 7,4 pH-Wert. Die Lösung auf ein Endvolumen von 1000 ml mit destilliertem H 2 O und filtriert, um Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Bereiten 1.000 x Stammlösungen von SAHA bei ~ 100 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) durch Auflösen von 26,4 mg SAHA in 1 ml DMSO. Verdünnen, um eine 1x (~ 10 pM)Lösung filtriert PBS für jeden Einsatz. Bewahren Sie die Stammlösung bei -20 ° C bis zu einem Monat. ACHTUNG: DMSO ist eine bekannte Toxin und mutagen. </li><li> Vorbereitung einer Lösung von 4% Paraformaldehyd (PFA) zum Fixieren. Unter einer chemischen Haube löst 4 g des PFA in 90 ml PBS. Das Gemisch wird auf 65 ° C und titriert auf einen pH von 7,4. Sobald die PFA gelöst hat, wird die Lösung auf ein Endvolumen von 100 ml. Lagern bei 4 ° C bis zu einem Monat. ACHTUNG: PFA ist eine bekannte allergen, krebserregend und giftig. </li><li> Vorbereitung 1x Blockierpuffer durch Verdünnen von 5 ml Ziegenserum und 500 &amp;mgr; l Triton X-100 in 94,5 ml PBS. </li><li> Vorbereitung 1x Waschpuffer durch Verdünnen von 500 ul Triton X-100 in 99,5 ml PBS. </li></ol> 2. Alkali-und Brandverletzungen Compound Behandlung <ol><li> Einweichen eines runden Filterpapiers, ~ 2 mm im Durchmesser, in einer Lösung von 1 M NaOH. </li><li> Betäuben die Maus bei einer Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin, whICH ist ~ 100 ul des Narkosecocktail aus Schritt 1.3 pro 25 g Maus. Anästhesie sollten, ~ 1-2 min bis cm Tiefe der Narkose gesetzt kann durch leichtes Kneifen der Zehen oder der Schwanz des Tieres ermittelt werden kann, wenn der Anästhesie reicht es sollte keine Antwort sein. Hinweis: Es sollte darauf geachtet werden, die Maus nicht auf die Anästhesie induzierte Hypothermie erliegen werden. </li><li> Mit einer Pipette, topisch einen Rückgang von 0,5% Proparacain Hydrochlorid gelten für die Hornhautoberfläche für lokale Analgesie. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, nehmen Sie ein Stück von NaOH getränkten Filterpapier. Wenn Sie bemerken, überschüssige NaOH klammerte sich an oder tropft aus dem Filterpapier, kurz tippen Sie auf die getränkten Filterpapier auf einem trockenen Stück Filterpapier, um das überschüssige absorbieren. Legen Sie das Stück von NaOH getränkten Filterpapier auf der zentralen Hornhaut. Lassen Sie es für 30 Sekunden, um einen spitzen Alkaliverbrauch von ca. 2 x 2 mm 2 Fläche erzeugen. Ein Operationsmikroskop ist hilfreich bei der Platzierung richtig das Filterpapier. Hinweis: Nur ein Auge der Maus sollte mit der andere dient als Kontroll verletzt werden. </li><li> Entfernen Sie das Filterpapier. Mit einem 10-ml-Spritze vorsichtig spülen Sie das Auge mit 10 ml 1x PBS zweimal weg zu waschen Rest 1 M NaOH. </li><li> Einen Tropfen 1x SAHA-Arbeitslösung (oder eine Fahrzeugsteuerung bestehend aus PBS DMSO, die keine SAHA) topisch auf die Hornhaut unmittelbar gelten. Wiederholen Anwendung 3 mal pro Tag für 14 Tage. Hinweis: in diesem Zeitraum eine topische antibiotische Salbe wird nicht empfohlen, da es mit der Entwicklung der Verletzung und der Abgabe der Verbindung stören. Verwenden eines flüssigen Antibiotika-Lösung, wie 3% Gentamycin-Lösung, statt. </li><li> Direkt in die Klinische Assessment (Protokoll Nr. 3 unten) oder opfern die Maus und entkernen die Augen für die Hornhaut flachen Halterung (Protokoll Nr. 4 unten) oder herkömmlichen Paraffin / gefroren Histologie. </li></ol> 3. Klinische Bewertung <ol><li> Führen Sie eine tägliche Prüfung der Mäuse im Blind unter einem Operationsmikroskop und Punkte corneal NV auf Basis von Hornhauttrübung, NV, und der Behältergröße. Verwenden Sie mindestens zwei Beobachter und nehmen Sie eine Endnote, die der Durchschnitt der beiden ist. <ol><li> Ergebnis Hornhauttrübung auf einer Skala von 0-4. 0 = völlig klar; 1 = leicht trüb, Iris und Pupille gut sichtbar; 2 = leicht trübe, Iris und Pupille noch nachweisbar; 3 = undurchsichtig, Schülerinnen und Schüler kaum nachweisbar; und 4 = völlig undurchsichtig, ohne Blick auf die Pupille. </li><li> NV Note auf einer Skala von 0-3. 0 = keine neovessels; 1 = neovessels am Hornhautrand; 2 = neovessels überspannt den Hornhautrand und nähert sich der Hornhautmitte; 3 = neovessels überspannt den Hornhautmitte. </li><li> Ergebnis Schiffsgröße auf einer Skala von 0-3. 0 = keine neovessels; 1 = neovessels unter Operationsmikroskop nachweisbar; 2 = neovessels leicht unter Operationsmikroskop gesehen; 3 = neovessels einfach und ohne Mikroskop gesehen. </li></ol></li><li> Mit einer Digitalkamera nehmen sie repräsentative Bilder des Auges an 7 Tagen und 14 Tagen. </li></ol> 4.Hornhaut-Färbung und Flat-Halterungen <ol><li> Fix entkernten Augen in 4% PFA für mindestens 1 h bei 4 ° C. </li><li> Bringen Sie den Blick auf PBS und 1x verwenden Pinzette vorsichtig entfernen überschüssiges Gewebe. </li><li> Mit Hilfe eines Operationsmikroskops, mit einer Nadel (18 Gauge) oder Mikro-Messer, um das pericorneale Bereich des Auges zu perforieren (Anmerkung: Dies sollte Flüssigkeit aus dem Auge freigeben). <ol><li> Aus der Perforation in Abschnitt 4.3.1 der Verwendung eines Paars von chirurgischen Schere, um den vorderen Teil des Auges (Kornea) vom hinteren Abschnitt zu schneiden. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Hornhaut wieder in 4% PFA zur Fixierung über Nacht bei 4 ° C </li><li> Entsorgen Sie die 4% PFA (ACHTUNG: PFA ist gefährlich und müssen in Einklang mit den institutionellen Vorschriften entsorgt werden) und spülen Sie die Hornhaut dreimal mit 1x PBS, um restliche PFA entfernen. </li><li> Inkubieren 1x Blockierungspuffer für mindestens 2 h bei Raumtemperatur, um das Gewebe zu permeabilisieren und nicht-spezifische Bindung zu verhindern, der den primären Antikörper. <ol><li> Primären Antikörper in 1x Blocking-Puffer bei einer 100-500 fache Verdünnung. (Z. B. Ratten-Anti-Maus-PECAM-1 zum Detektieren von Blutgefäßen bei 1:100 Kaninchen-anti-Maus-LYVE-1 zum Erfassen Lymphgefäße an 1:500, und / oder Ratte anti-mouse-F4/80 zum Erfassen Makrophagen bei 1:100). Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Wasche sechsmal mit 1x Waschpuffer für 1 Stunde jeweils bei Raumtemperatur, um ungebundenen primären Antikörper vollständig zu entfernen. </li><li> Tragen Sie einen sekundären Antikörper in 1x Blocking-Puffer in einem 500-1000 fachen Verdünnung. (Z. B. eine 488 nm fluoreszierenden markierten Ziege-anti-Ratte-IgG bei 1:800 oder 594 nm Fluoreszenz-markierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG bei 1:800). Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Dreimaliges Waschen mit 1 × PBS für jeweils 1 h bei Raumtemperatur, um ungebundenen sekundären Antikörper vollständig zu entfernen. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Hornhaut in frischen 1x PBS und mit Hilfe eines Operationsmikroskops, sorgfältig zu vier Schnitte von der Peripherie in Richtung Prozentäh. Dies sollte die Hornhaut in vier Quadranten von ungefähr gleicher Größe aufteilen (die resultierende Form eher wie ein Schmetterling anschauen) und lassen Sie es auf einer Folie flach liegen. </li><li> Montieren Sie mit einem Montage geeignete Medium für Fluoreszenz-Bildgebung. Für beste Ergebnisse sollten die Proben sofort abgebildet und digitale Fotografien gemacht werden, sondern kann mehrere Wochen vor Licht bei 4 ° C gelagert werden geschützt </li></ol>

<ol>
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Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgestellte Protokoll ergibt reproduzierbare Ebenen der hemangiogenesis, Lymphangiogenese und Entzündungen, so dass es ein ideales System, um diese drei (miteinander) Prozesse zu studieren. Während diese Methode produziert zentralen Hornhaut NV, mehrere Methoden, die entwickelt wurden, um mehr gerichtet NV, nämlich das Nähen der Hornhaut verursachen und 17 Wachstumsfaktor-exprimierenden Pellets 18 implantiert, könnten ebenfalls von Interesse sein. Unser Protokoll ist für den Einsatz...

Hornhautblindheit ist die vierthäufigste Ursache für Erblindung, für ca. 4% aller Fälle 1 verantwortlich. Hornhaut-Neovaskularisation (NV) spielt eine bedeutende Rolle in vielen dieser Erkrankungen, einschließlich Herpes-Keratitis (der führende infektiöse Ursache für Erblindung im Westen) und Trachom (die häufigste Ursache für Blindheit weltweit Infektions) 2. Aktuelle Therapien umfassen Steroide, nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs), Anti-VEGF-Therapien und Cyclosporin A als auch konventionelle oder Laseroperationstechniken 3. , Die stark schwächende Natur der Hornhaut NV basierend Pathologien, der Mangel an chirurgischen Einrichtungen in der Lage, die Behandlung von Hornhaut NV, und das Fehlen einer dringend, pharmakologische Option führte jedoch eine aktuelle Expertenrunde zu dem Schluss, dass trotz der vorhandenen Therapien, die grundlegende medizinische Bedarf von diesen Pathologien vorgestellt bleibt unerfüllte 4. Der menschlichen Hornhautbesteht aus 5 Schichten, drei Zellschichten (Epithel-, Stroma und Endothel) und 2-Schnittstelle (Bowman-Membran und Descemet-Membran). Es fungiert als mechanische Barriere und Brechungsfläche für das Auge. Sein transparentes Natur ist die Folge einer empfindlichen Balance ihrer Bestandteile und ist integraler Bestandteil seiner richtigen Funktion 5. Normalerweise avaskuläre, erhält der Hornhaut Blut von Mikrogefäßen entlang der Außenkante, die aus der Augenheilkunde und ciliary Arterien gespeist ausgeführt werden. Hornhaut NV tritt auf, wenn ein Stimulus Angiogenese fördert dieser Behälter so dass sie in Richtung der Mitte der Hornhaut zu wachsen und somit Vision 6 begrenzen. Hornhaut-Angiogenese und Lymphangiogenese hemangiogenesis enthält, die in das Einwachsen von Blutgefäßen und Lymphgefäßen aus dem Limbus Gefäßarkade in Richtung der Mitte der Hornhaut führen. Dies führt zu einem Zusammenbruch der Hornhaut &quot;angiogenen Privileg&quot;, eine Erhöhung der Hornhauttrübung und Fibrose, Störung der Hornhaut laAnwälten, 7 und Ödeme. Die genauen Auslöser von Hornhaut NV zahlreich sind, die von einer Reaktion auf Infektionskrankheiten, wie Bindehautentzündung zu einer chemisch induzierten Zustand verursacht traditionellen Arzneimitteln, Industriechemikalien, oder auch chemische Kampfstoffe. Die molekularen Mechanismen, die an diesem Verfahren sind nicht, wie noch vollständig charakterisiert; aber ein paar wichtige Spieler sind identifiziert worden. Unter normalen Bedingungen ist die Hornhaut besitzt eine einzigartige &quot;angiogenen Privileg durch eine redundante Anordnung von anti-angiogenen Faktoren (wie lösliche VEGF-R1) 8 gehalten. Als Reaktion auf einen externen Stimulus (z. B. einer Verletzung), es wird eine lokale Hochregulation von pro-angiogenen Faktoren (z. B. VEGF-A). Diese Tipps das Gleichgewicht der pro-und anti-angiogenen Faktoren, die angiogene Privileg der Hornhaut zu Grunde liegt, und führt zu hemangiogenesis, lymphangeogenesis und Entzündung, daher verursacht Hornhautpathologie und sogar Blindheit 9. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Angesichts der nicht gedeckten medizinischen Bedarf dieser stark beeinträchtigende Krankheit, von Interesse für den Bereich ist es, eine zuverlässige Tiermodell der Hornhaut NV haben. Hier präsentieren wir ein solches Modell: kontrollierte alkaliBrandVerletzungen. Verschiedene Augenverletzung Modelle, die auf Verwendung von Filterpapier Ringe sind seit 1970 10 verwendet worden. 1989, dadurch gekennzeichnet, eine Gruppe der Harvard Medical School Ophthalmologen ein Standardmodell eines zentralen Hornhautalkalibrandverletzung bei Kaninchen anhand von Einweichen ein Stück Papierrundfilter mit Natriumhydroxid (NaOH) und es auf die Hornhaut in einem bestimmten Bereich von Konzentrationen 11. Seitdem hat sich diese Technik für die Verwendung in der Maus 12-14 angepasst. Vor kurzem untersuchte das Labor Wang die therapeutische Wirkung des Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitor SAHA in der Pathogenese der Hornhaut NV mit einer Maus Hornhautalkali Verbrennungen Modell 15. Die Methodik der Maus Hornhautalkali Verbrennungen hier vorgestellten Modell gebaut wurdevor allem auf die Arbeit von zwei anderen Papieren 14,16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mL Syringe</td>
			<td style="width:96px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">18 Guage Needle</td>
			<td style="width:96px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 mL Syringe</td>
			<td style="width:96px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">306575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25 Guage Needle</td>
			<td style="width:96px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-F4/80 (rat anti-mouse)</td>
			<td style="width:96px;">AbD Serotech</td>
			<td>MCA497RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)</td>
			<td style="width:96px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab14917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)</td>
			<td style="width:96px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat)</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit)</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera</td>
			<td style="width:96px;">Tucsen</td>
			<td style="width:119px;">TCC 5.0 ICE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslips</td>
			<td style="width:96px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4540-1L</td>
			<td>Caution: Mutagenic, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps (Blunt), Iris</td>
			<td style="width:96px;">WPI</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps (Sharp), Dumont #4</td>
			<td style="width:96px;">WPI</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:96px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine Solution</td>
			<td style="width:96px;">MedVet</td>
			<td>RXKETAMINE</td>
			<td>Controlled substance, proper license required for use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light Source for Microscope</td>
			<td style="width:96px;">AmScope</td>
			<td style="width:119px;">LED-14M-YA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope (Stereo 7X-45X)</td>
			<td style="width:96px;">AmScope</td>
			<td style="width:119px;">SM-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mounting Medium, Vectashield</td>
			<td style="width:96px;">Vector</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:96px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:96px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:96px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S318-1</td>
			<td>Caution: Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;">P6148-500G</td>
			<td>Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proparacaine Hydrochloride</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4554-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissors (5mm blade), Vanas</td>
			<td style="width:96px;">WPI</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:96px;">MPBio</td>
			<td align="right" style="width:119px;">92939249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:96px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Whatman Grade 1 Filter Paper</td>
			<td style="width:96px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">1001-6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine Solution</td>
			<td style="width:96px;">MedVet</td>
			<td style="width:119px;">RXANASED-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse

Unter normalen Bedingungen ist die Hornhaut avaskulären, und diese Transparenz ist wichtig für die Erhaltung der Sehschärfe. Neovaskularisation (NV) der Hornhaut, die durch Trauma, Keratoplastik oder ansteckende Krankheit verursacht werden kann, bricht die so genannte &quot;angiogenen Privileg&quot; der Hornhaut und bildet die Grundlage für mehrere visuelle Pathologien, die bis zur Erblindung führen kann. Obwohl es mehrere Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung, bleibt das grundlegende medizinische Notwendigkeit durch Hornhaut neovaskulären Erkrankungen vorgestellt ungedeckten. Um eine sichere, effektive und zielgerichtete Therapien zu entwickeln, ist ein zuverlässiges Modell der Hornhaut NV und pharmakologische Intervention erforderlich. Hier beschreiben wir ein alkali Verbrennungen corneale Neovaskularisierung Modell in der Maus. Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Anwendung eines kontrollierten alkali Verbrennungen der Hornhaut, die Verabreichung einer pharmakologischen Verbindung von Interesse, und die Visualisierung des Ergebnisses. Diese Methode könnte sich als Instrumentalisierungtal für die Untersuchung der Mechanismen und Interventionsmöglichkeiten in der Hornhaut NV und anderen neovaskulären Erkrankungen.

Nach alkaliBrandVerletzung tritt Hornhaut NV auf eine zuverlässige, zeitabhängig. Abbildung 1 zeigt den krassen Unterschied sowohl in der Gefäßneubildung und Hornhauttrübung zwischen einem unbehandelten Tier (Abbildung 1A) und einem Tier mit dem HDAC-Inhibitor SAHA (Abbildung 1B behandelt ) bei der 7-tägigen Zeitpunkt. 2A und 2B zeigen eine Hornhaut flachen Halterung einer unbehandelten Kontrollauge mi...

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An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Neovaskularisation (NV) der Hornhaut können mehrere optische Pathologien erschweren. Mit Hilfe eines kontrollierten, alkali Verbrennungen Modell kann ein quantifizierbarer Höhe der Hornhaut NV für mechanistische Studie der Hornhaut NV und Bewertung von möglichen Therapien für neovaskulären Erkrankungen hergestellt werden.

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K Aufrufe.  Tulane University.  Neovaskularisation (NV) der Hornhaut können mehrere optische Pathologien erschweren. Mit Hilfe eines kontrollierten, alkali Verbrennungen Modell kann ein quantifizierbarer Höhe der Hornhaut NV für mechanistische Studie der Hornhaut NV und Bewertung von möglichen Therapien für neovaskulären Erkrankungen hergestellt werden. 

Serie: An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Renale Ischämie Reperfusionsschaden: Ein Maus-Modell der Schädigung und Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Forschung

Medizin

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induktion von beschleunigter Atherosklerose bei Mäusen: Das "Wire-Injury"-Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

Ein Mausmodell der einzelnen und repetitiven milden traumatischen Gehirnverletzung

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

A Novel Approach to Monitoring Graft Neovascularization in the Human Gingiva

Laser speckle contrast imaging (LSCI) is a novel method for measuring superficial blood perfusion over large areas. Since it is non-invasive and avoids direct contact with the measured area, it is suitable for monitoring blood flow changes during wound healing in human patients. Vestibuloplasty is periodontal surgery to the oral vestibule, aiming to restore vestibular depth with simultaneous enlargement of the keratinized gingiva. In this special clinical case, a split thickness flap was elevated at the first upper premolar and a xenogenic collagen matrix was adapted to the resulting recipient bed. LSCI was used to monitor the re- and neovascularization of the graft and the surrounding mucosa for one year. A protocol is introduced for the correct adjustment of microcirculation measurement in the oral mucosa, highlighting difficulties and possible failures.
The clinical case study presented demonstrated that &#8212; following the appropriate protocol &#8212; LSCI is a suitable and reliable method for following up microcirculation in a healing wound in the human oral mucosa and gives useful information on graft integration.

This study introduces a protocol for measuring microcirculation in human oral mucosa by laser speckle contrast imaging. The monitoring of wound healing after vestibuloplasty combined with a xenogenic collagen graft is presented on a clinical case.

Ein neuer Ansatz zur Überwachung Graft Neovaskularisation in der menschlichen Gingiva

Laser speckle contrast imaging (LSCI) is a novel method for measuring superficial blood perfusion over large areas. Since it is non-invasive and avoids ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for experimental investigations as they are normally needed for transplantation. Endothelial cell cultures often do not translate well to in vivo situations. Due to the biostructural characteristics of non-human corneas, stromal swelling during cultivation induces substantial corneal endothelial cell loss, which makes it difficult to perform cultivation for an extended period of time. Deswelling agents such as dextran are used to counteract this response. However, they also cause significant endothelial cell loss. Therefore, an ex vivo organ culture model not requiring deswelling agents was established. Pig eyes from a local slaughterhouse were used to prepare split corneal buttons. After partial corneal trephination, the outer layers of the cornea (epithelium, bowman layer, parts of the stroma) were removed. This significantly reduces corneal endothelial cell loss induced by massive stromal swelling and Descemet&#39;s membrane folding throughout longer cultivation periods and improves general preservation of the endothelial cell layer. Subsequent complete corneal trephination was followed by the removal of the split corneal button from the remaining eye bulb and cultivation. Endothelial cell density was assessed at follow-up times of up to 15 days after preparation (i.e., days 1, 8, 15) using light microscopy. The preparation technique used allows a better preservation of the endothelial cell layer enabled by less stromal tissue swelling, which results in slow and linear decline rates in split corneal buttons comparable to human donor corneas. As this standardized organo-typically cultivated research model for the first time allows a stable cultivation for at least two weeks, it is a valuable alternative to human donor corneas for future investigations of various external factors with regards to their effects on the corneal endothelium.

Here, a step-by-step protocol for the preparation and cultivation of porcine split corneal buttons is presented. As this organo-typically cultivated organ culture model shows cell death rates within 15 days, comparable to human donor corneas, it represents the first model allowing long-term cultivation of non-human corneas without adding toxic dextran.

Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...