Dieses Video wird eine detaillierte Beschreibung, wie eine orthotopische rechte Hinterglied, Mittelschenkel transplantierte Ratte durchführen. Die Spenderratte rechts hintere Gliedmaße wird in der Mitte des Oberschenkels amputiert und dann auf Eis gelagert. Die Empfängerratte rechts hintere Gliedmaße wird auch auf mittlerer Oberschenkelebene amputiert.
Die Spenderratte wird dann an der Empfängerratte befestigt. Wir werden beschreiben, wie man das Knochen-, Arterien-, Venen-, Nerven-, Muskel- und Hautsystem wieder anbringt. Die Gliedmaßentransplantation, genauer gesagt, die vaskularisierte Komposit-Allotransplantate, VCA, hat ein breites therapeutisches Versprechen.
Aber es ist derzeit durch Techniken begrenzt,Immunsuppression, und schlechte funktionelle neuromotorische Erholung. Unser Modell betont akribische, bewährte mikrochirurgische Techniken wie handgenähte Vaskuläre Anastomose und neuronale Koaptation. Wir haben über 200 dieser Operationen in über einem Jahr durchgeführt.
Obwohl es eine erste Lernkurve zum beginnenden Mikrochirurgen gibt, wird jeder Mikrochirurg in der Lage sein, dieses Modell zu meistern, indem er dieses Video verwendet, um unsere Methode und ihr Engagement für eine engagierte Praxis zu lernen. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health, NIH, durchgeführt und vom Northwestern University Animal Care and Use Committee genehmigt. Die spezifischen Prozeduren wurden auf einem Protokoll IS 00001663 durchgeführt.
Wählen Sie eine Ratte im Alter von acht bis 16 Wochen mit einem Gewicht zwischen 250 und 400 Gramm zum Zeitpunkt der Operation. Induzieren Sie die Vollnarkose mit 5%isoflurane durch einen Verdampfer, bevor sie das Hintergliedfell der Ratte stutzt. Mit einem Nasenkegel, um die Anästhesie zwischen zwei bis 2,5% zu halten, positionieren Sie die Ratte auf dem Operationsbrett mit einer Heizung darunter.
Desinfizieren Sie die haarlose Haut mit 70% Reiben Von alkohol und schützen Sie das operationschirurgische Feld mit steriler Gaze. Mit einem geeigneten mikrochirurgischen Mikroskop und den hier gezeigten mikrochirurgischen Instrumenten sowie leicht zugänglichen bipolaren und monopolaren Elektrokauterien können Sie mit der Zerlegung beginnen. Verwenden Sie eine Schere, um einen Umfangs- und Hautschnitt um die rechte Hintergliedmaße zu machen.
Beginnen Sie in der Leistenfalte sofort auf etwa dem gleichen Niveau wie das Leistenband und verlängern Sie dorsal seitlich, um den Umfangsschnitt abzuschließen. Und dann die Muskelschicht direkt unter dem Schnitt aussetzen, sezieren und kauterisieren die oberflächlichen epigastrischen Gefäße, die von der Muskelschicht zur gerade erzeugten proximalen Hautklappe führen. Reflektieren Sie die proximale Klappe superomedial auf das Leistenband und die distale Hautklappe inferolaterally auf das Knie.
Verwenden Sie einen Drahtretraktor oder gewalzte Gaze, um das Feld freizulegen. Beobachtet, dass die Leistenanatomie der Ratte ist ähnlich wie Menschen;von lateral bis medial liegen der Nerv, arterien, und Vene. Sezieren Sie den Oberschenkelnerv, teilen Sie ihn scharf am Leistenband proximal, um die Bifurkation, wenn möglich.
Ziehen Sie den geteilten Nerv minderwertig zurück und halten Sie ihn sicher aus dem Weg, bedeckt unter feuchter Gaze. Die Aufmerksamkeit auf die Oberschenkelarterie und Vene verwenden vier Zentimeter lange 7-0 Seidenbinden, um die Gefäße atraumatisch zurückzuziehen, anstatt sie direkt zu handhaben. Wenn Sie jetzt genau hinachten, verbessern Sie Ihr endgültiges anastomotisches Ergebnis.
Ligate alle Zweige der Femoralgefäße mit 7-0 Seidenkrawatten. Teilen Sie die Zweige zwischen den Bindungen auf. Arterielle und venöse Zweige, die eine Teilung erfordern, umfassen den oberflächlichen Zirkumflex iliac und die Muskelgefäße.
Die oberflächliche Zirkumflex-Iliac ist in der Regel am größten und scheint tief zu tauchen, wie die profunda femoral beim Menschen, aber die Profunda fehlt in der Ratte. Distaler zweige der Femoralgefäße, wie höchste Genicular und der saphenous Zweig erfordern in der Regel keine Teilung. Nun ligate die Oberschenkelarterie mit 7-0 Seidenkrawatten als proximal zum Leistenband wie möglich und teilt zwischen den Krawatten.
Ähnlich wie die Arterie, ligate und teilen Sie die femorale Vene. Reflektieren Sie sowohl Arterie als auch Vene minderwertig, sicher aus dem Weg, bedeckt unter feuchter Gaze zusammen mit dem Oberschenkelnerv zuvor bedeckt. Sezieren Sie die ventralen Muskelgruppen und achten Sie darauf, jedes sichtbare Gefäß, das entsteht, zu kauterisieren.
Aufmerksamkeit auf Hämostase jetzt wird Empfänger Blutverlust während der Reprofusion später minimieren. Tief zu den ventralen Muskelgruppen, identifizieren und stark teilen Sie den Ischiasnerv proximal zu seinen Zweigen. Alle drei Ischiaszweige sind in der Regel sichtbar, tibial, peroneal und ural.
Alle drei sollten in der Spender-Extremität erhalten bleiben. Ein vierter Kutanzweig ist in dieser Zerlegung normalerweise nicht zu sehen. Beenden Sie die Teilung der verbleibenden ventralen und dorsalen Muskelgruppen auf mittlerer Oberschenkelebene mit akribischer Hämostase.
Es kann notwendig sein, die Gliedmaße zwischendurch zurückzuziehen, um die Teilung der Muskeln zu vollenden. Transect den Oberschenkelknochen in der Mitte welle mit einer Hand-Akku-Drehsäge. Die Gliedmaße ist nun frei vom Spender.
Nachdem Sie das Gliedmaßentransplantat vom Spender entfernt haben, schneiden Sie die seidengebundenen Enden von der Transplantatseite femoralarterienundund die Venenstümpfe, wodurch die Gefäße wieder geöffnet werden. Legen Sie einen 24-Spur-Angiokatheter in den Transplantatarterienstumpf ein und spülen Sie das Transplantat mit 250 internationalen Einheiten Heparin in 5 Milliliter eiskalte normaler Saline verdünnt, wobei Sie darauf achten, dass es aus der offenen Vene fließt. Langsam, spülen Sie das Transplantat für etwa drei Minuten sanft.
Überschüssige seimful Spülung kann das Endothel beschädigen. Legen Sie das Transplantat in eine gekühlte Salineschale, die in einem Eiskübel verschachtelt ist, bis zur Transplantation. Euthanisieren Sie die Spenderratte mit bilateraler Thorakotomie.
Die Empfängeroperation beginnt ähnlich wie die Spenderoperation, die Anästhesisierung der Ratte, das Schneiden des Fells, einen umfangvollen Schnitt in der Leistenfalte, reflektiert die Hautklappen, seziert den Oberschenkelnerv, die Arterie und die Vene. Und die gleichen Zweigschiffe wie zuvor beschrieben. Während dieser Operation jedoch den Oberschenkelnerv differenzierter als für den Spender, aber proximal, wenn möglich, zur Bifurkation.
Teilen und befreien Sie die Oberschenkelarterie und Vene und klemmen Sie sie jeweils auf der Ebene des Leistenbandes mit mikrochirurgischen Bulldoggenklemmen. Setzen Sie die Operation wie zuvor beschrieben fort, indem Sie die ventralen Endorsenmuskeln des Oberschenkels auf mittlerer Oberschenkelebene mit akribischer Hämostase teilen, während die Extremität bei Bedarf medial zurückgezogen wird. Identifizieren und teilen Sie den Ischiasnerv proximal an den Astpunkt und transsektieren Sie den Oberschenkelknochen an der Mitte der Welle mit der Drehsäge.
Entfernen Sie das native Recht des Empfängers und entsorgen Sie es entsprechend den lokalen Richtlinien des Tierschutz- und Nutzungsausschusses. Es ist in dieser Phase sehr wichtig, das Isofluran emitenzte auf ein bis 1,5% durch den Nasenkegel zu drehen. Zu viel Anästhesie während dieses weniger schmerzhaften Teils des Verfahrens wird zum Tod der Ratte führen.
Es ist an der Zeit, die Knochen zusammenzut. Mit der Handdrehsäge, rasieren Sie alle Unregelmäßigkeiten von der Spender und Empfänger Oberschenkelknochen geschnitten enden. Schneiden Sie das Nabenende einer 18-Spur-Nadel ab, die zur Intramedullärstange des Oberschenkelknochens wird.
Bevor Sie den Knochen manipulieren, wenden Sie eine kleine Menge eines Knochenwachses auf das empfängergeschnittene Ende des Oberschenkelknochens an, um die Knochenblutung während des Reaming-Prozesses zu reduzieren. Koapt den Spender und Empfänger Femoral Knochen mit der 18-Spur-Nadel als intramedulläre Rute. Eine gewisse Kraft ist notwendig, aber nicht ream entweder Knochen so weit, um den Kortex zu brechen.
Entfernen Sie bei Bedarf die Nadel und trimmen Sie sie auf eine unangemessene Länge, so dass beide Knochen problemlos über die Nadel passen, ohne dass eine Nadel zwischen den Knochen zeigt. Legen Sie eine kleine Stütze wie ein Pad Gaze oder einen kleinen Felsen oder Modellierton unter die Spenderglied, um sie von Spannung fernzuhalten. Die ventralen Muskelgruppen mit acht bis zehn einfachen unterbrochenen 5-0 Polyglactin-Nähten neu annähern, damit sich das Transplantat nicht um die Oberschenkelnadel dreht.
Dies gibt dem Glied Stabilität für die Anastomosen. Beginnen Sie nun mit den Anastomosen. Bewässern Sie regelmäßig das Transplantat und das Operationsfeld mit eiskalter Saline, um eine bessere Visualisierung zu ermöglichen und ischämische Reperfusionsverletzungen zu reduzieren.
Richten Sie die Spender- und Empfängerfemoralarterien und Anastomose in End-to-End-Manier mit einfachen unterbrochenen 10-0 Nylon-Nähten aus, wodurch sowohl Spannung als auch Looping vermieden werden. Die Arterie benötigt durchschnittlich sechs Nähte. Ähnlich wie die Arterie, anastomose der Spender und Empfänger Femoral Venen in End-to-End-Manier.
Die Vene erfordert sechs bis acht Nähte. Großzügige kaltherzig bewässernde, atraumatische Gefäßhandhabungstechnik und lange Schwänze als Staunähte für den Gefäßrückzug sind wichtige Werkzeuge für effektive mikrochirurgische Anastomosen. Legen Sie eine moderate Menge an hämostatischem Cellulosepulver auf beide Anastomosen, und entfernen Sie anschließend die proximalen mikrochirurgischen Bulldoggenklemmen an der Vene und der Arterie.
Prüfen Sie beide Anastomosen auf gute Durchgängigkeit und Strömung. Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Vene sanft zu prod und überprüfen Sie für gute Hämostase auf beiden Anastomosen. Wenn beide Anastomosen zufriedenstellend bestätigt werden, trimmen Sie alle verbleibenden langen Bleiben Nähte Schwänze, um die anderen zu entsprechen.
Repositionieren sie die Ratte auf die linke seitliche Dekubitusposition, verwenden Sie die liberale Elektrokauterie, um eine akribische Hämostase jeder Reperfusionsmuskelblutung zu erreichen. Die Aufmerksamkeit richtet sich auf die Nervenanastomosen, sobald Muskelhämostase gewährleistet ist. Die dorsalen Muskelgruppen, die direkt unter dem Ischiasnerv liegen, mit einfachen unterbrochenen 5-0 Polyglactin-Nähten neu annähern.
Schneiden Sie alle Nervenschnitten zurück, die zerrissen erscheinen. Den Ischiasnerv mit 10-0 Nylonnähten, die nach epineuralen Bissen streben, neu anzunähern. Acht bis zehn einfache unterbrochene Nähte reichen in der Regel aus.
Die verbleibenden dorsalen Muskelgruppen mit 5-0 Polyglactin-Nähten neu annähern. Dann schließen Sie die dorsale Haut mit 4-0 Polyglactin kontinuierlich laufende Naht. Neupositionierung der Ratte zur Supine-Position, Neuannäherung des Oberschenkelnervs mit 10-0 Nylon-Nähte, wieder, streben nach epineuralen Bissen.
Zwei bis drei einfache unterbrochene Nähte reichen in der Regel aus. Schließen Sie die verbleibende ventrale Haut auf die gleiche Weise wie die rückende Haut. Vermeiden Sie überschüssigen Nähteschwanz, der die Ratte nach dem Erwachen reizen kann.
Sobald die Tiere aus dem unmittelbaren postoperativen Fenster sind, können sie auf neuromotorische Erholung getestet werden. Der Hargreaves-Test wird verwendet, um die thermische Empfindung zu testen. Legen Sie die Ratte in den Testbehälter und lassen Sie sie sich 20 Minuten lang akklimatisieren.
Das Geräteglas ist sauber bestätigt, und die Wärmequelle wird bestätigt, mit dem Finger des Ermittlers zu arbeiten. Bestätigen Sie vor dem Testen, dass die Ratte wach ist und die getestete Pfote über dem Infrarot-Bewegungsmelder positioniert ist. Übertragen Sie wärmeenergetische Energie auf Intensitätsstufe 90.
Zeitverzögerung enden, wenn das Tier seine Pfote von der Wärmequelle wegbewegt. Wenn innerhalb von 20 Sekunden keine Bewegung auftritt, wird der Test abgebrochen, um Verletzungen zu vermeiden. Erhalten Sie fünf Versuche pro getesteter Gliedmaße, ohne den höchsten und niedrigsten Wert, bevor Sie die durchschnittliche Wartezeit für die Entzugswartezeit für jedes Tier berechnen.
Hier ist operatives Design im Cartoon-Format dargestellt. Die rechte Hinterseite sowohl der Spender- als auch der Empfängerratten wird im mittleren Oberschenkelals als ischiasischer Querschnitt amputiert. Femoralarterie, Vene und Nerven sowie der Ischiasnerv und der Oberschenkelknochen müssen dann in der Empfängerchirurgie wieder verbunden werden.
Das Modell kann verwendet werden, um differentiale Überlebenseffekte der Immunsuppression und Transplantationsstrategie zu zeigen. Mit dieser Technik ist ein langfristiges Überleben erreichbar. Das Modell kann verwendet werden, um die sensorische Nervenregeneration zu untersuchen, die postoperativ um vier Wochen sichtbar sein kann.
Motorfunktion kann auch mit einer Ganganalyseplattform abgefragt werden. Hier haben wir eine Rattenmodellplattform mit günstigen Überlebenseigenschaften vorgestellt, mit der wir die sensorische und motorische Rückgewinnung sonden, wie in den Verfahrenszahlen zu sehen ist. Limb Transplantation unter der breiteren Kategorie der VCA, vaskularisierte Komponente Allotransplantation hat weithin anwendbare therapeutische Versprechen ist noch unerfüllt.
Die wichtigsten Straßensperren Linie aktuelle Immunsuppression und neuromotorische Erholungstechniken. Die Entwicklung neuer Techniken wird von einer flexiblen, robusten und reproduzierbaren Tiermodellierung abhängen. Mit dieser Plattform hoffen wir, dass die Ermittler in der Lage sein werden, mehrere Facetten der Gliedmaßentransplantation voranzutreiben.
Vielen Dank für Das Zuschauen und viel Glück in Ihren nächsten Schritten.
