Dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata

Este video proporcionará una descripción detallada, cómo realizar una extremidad posterior ortotópica, rata trasplantada de muslo medio. La extremidad posterior derecha de la rata donante se amputa a nivel del muslo medio y luego se almacena en hielo. La extremidad posterior derecha de la rata receptora también se amputa a nivel medio del muslo.

A continuación, la extremidad de la rata donante se une a la rata receptora. Describiremos cómo volver a conectar los sistemas óseo, arterial, vena, nervio, muscular y piel. El trasplante de extremidades, más específicamente, el atransplante compuesto vascularizado, VCA, tiene una amplia promesa terapéutica.

Pero actualmente está limitado por técnicas, inmunosupresión y recuperación neuromotor funcional deficiente. Nuestro modelo hace hincapié en técnicas microquirúrgicas meticulosas probadas en el tiempo, como la anastomosis vascular cosida a mano y la coaptación neuronal. Hemos realizado más de 200 de estas cirugías en más de un año.

Aunque hay una curva de aprendizaje inicial para el microcirujano inicial, al usar este video para aprender nuestro método y su compromiso con la práctica dedicada, cualquier microcirujano será capaz de dominar este modelo. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, NIH, y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los procedimientos específicos se realizaron en un protocolo IS 00001663.

Seleccione una rata de ocho a 16 semanas de edad que pese entre 250 y 400 gramos en el momento de la cirugía. Inducir anestesia general con 5%isoflurano a través de un vaporizador antes de recortar el pelaje de las extremidades traseras de la rata. Usando un cono nasal para mantener la anestesia entre dos y 2.5%posicione a la rata en la placa de operaciones con un calentador debajo.

Desinfectar la piel sin pelo con 70% de alcohol y proteger el campo quirúrgico con gasa estéril. Usando un microscopio microquirúrgico apropiado y los instrumentos microquirúrgicos que se muestran aquí, junto con la electrocauterización bipolar y monopolar fácil de acceder, estará listo para comenzar la disección. Usa unas tijeras para hacer una incisión circunferencial y cutánea alrededor de la extremidad posterior derecha.

Comience en el pliegue inguinal inmediatamente a aproximadamente el mismo nivel que el ligamento inguinal y extienda dorsal lateralmente para completar la incisión circunferencial. Y luego exponer la capa muscular directamente debajo de la incisión, diseccionar y cauterizar los vasos epigástricos superficiales, que conducen desde la capa muscular hasta el colgajo de la piel proximal que acaba de crear. Refleja el colgajo proximal casimedialmente al ligamento inguinal y el colgajo distal de la piel de forma inferolateral a la rodilla.

Utilice un retractor de alambre o una gasa enrollada para ayudar a exponer el campo. Observó que la anatomía inguinal de la rata es similar a los seres humanos;de lateral a medial mentira el nervio, la arteria y la vena. Diseccionar el nervio femoral, dividirlo bruscamente en el ligamento inguinal proximal a la bifurcación, si es posible.

Retirar el nervio dividido inferiormente, manteniéndolo a salvo fuera del camino, cubierto bajo gasa húmeda. La atención a la arteria femoral y la vena utilizan lazos de seda de cuatro centímetros de largo 7-0 para retraer los vasos de forma atraumática en lugar de manipularlos directamente. Ahora prestar mucha atención mejorará el resultado análisistomótico final.

Ligar todas las ramas de los vasos femorales con lazos de seda 7-0. Divida las ramas entre los lazos. Las ramas arteriales y venosas que requieren división incluyen el circunflejo superficial ilíaco y los vasos musculares.

El circunflejo iliac superficial es generalmente más grande y parece sumergirse profundamente como lo haría el femoral profundo en los seres humanos, pero la profundidad está ausente en la rata. Las ramas más distales de los vasos femorales, como la rama genicular más alta y la rama safenosa, generalmente no requieren división. Ahora ligar la arteria femoral con lazos de seda 7-0 tan proximales al ligamento inguinal como sea posible y dividir entre los lazos.

Similar a la arteria, ligar y dividir la vena femoral. Reflejar la arteria y la vena de manera inferior, segura fuera del camino, cubierto debajo de la gasa húmeda junto con el nervio femoral cubierto previamente. Diseccionar los grupos musculares ventrales, teniendo cuidado de cauterizar cualquier vaso visible que surja.

La atención a la hemostasia ahora minimizará la pérdida de sangre del receptor durante la reprofusión más tarde. Profundo a los grupos musculares ventrales, identificar y dividir bruscamente el nervio ciático proximal a sus ramas. Las tres ramas ciáticas son generalmente visibles, tibiales, peroneales y sural.

Los tres deben conservarse en la extremidad del donante. Una cuarta rama cutánea no se ve típicamente en esta disección. Termina de dividir los grupos musculares ventrales y dorsales restantes a nivel del muslo medio con una meticulosa hemostasia.

Puede ser necesario retraer la extremidad mediamente para completar la división de los músculos. Transect the fémur bone at mid-shaft using a handheld cordless rotary saw. La extremidad está ahora libre del donante.

Después de haber retirado el injerto de la extremidad del donante, corte los extremos atados de seda de la arteria femoral lateral del injerto y los tocones de las venas, abriendo así los vasos. Inserte un angiocatéter de calibre 24 en el muñón de la arteria del injerto y enjuague el injerto con 250 unidades internacionales de heparina diluidas en 5 mililitros de solución salina normal helada, teniendo cuidado de ver que fluye fuera de la vena abierta. Lentamente, enjuague suavemente el injerto durante unos tres minutos.

El lavado excesivo de la fuerza puede dañar el endotelio. Coloque el injerto en un plato salino frío anidado en un cubo de hielo hasta el trasplante. Eutanasia la rata donante con toracotomía bilateral.

La cirugía receptora comienza de manera similar a la cirugía del donante, anestesiando a la rata, recortando el pelaje, haciendo una incisión circunferencial en el pliegue inguinal, reflejando los colgajos de la piel, diseccionando el nervio femoral, la arteria y la vena. Y ligando los mismos buques de rama como se describió anteriormente. Sin embargo, durante esta operación, divida el nervio femoral más distalmente que para el donante, pero proximally a la bifurcación si es posible.

Divida y libere la arteria femoral y la vena y sujete aproximadamente respectivamente al nivel del ligamento inguinal con abrazaderas de bulldog microquirúrgicas. Continuar la cirugía como se describió anteriormente, dividiendo los músculos ventrales que avalan el muslo a nivel del muslo medio con la forma meticulosa de hemostasis, mientras retrae la extremidad medialmente según sea necesario. Identifique y divida el nervio ciático proximal al punto de rama y transecte el fémur en el eje medio utilizando la sierra giratoria.

Retire la extremidad posterior derecha nativa del destinatario y deseche apropiadamente de acuerdo con las directrices locales del Comité de Cuidado y Uso de Animales. Es muy importante en esta etapa bajar el isoflurano al uno a 1,5% a través del cono nasal. Demasiada anestesia durante esta parte menos dolorosa del procedimiento conducirá a la muerte de la rata.

Es hora de juntar los huesos. Usando la sierra giratoria de mano, afeite cualquier irregularidad tanto de los extremos de corte del fémur del donante como del receptor. Corte el extremo del cubo de una aguja de calibre 18, que se convertirá en la varilla intramedular del fémur.

Antes de manipular el hueso, aplique una pequeña cantidad de cera ósea en el extremo cortado del hueso del fémur para reducir el sangrado de la médula durante el proceso de escariado. Coapt los huesos femorales del donante y del receptor utilizando la aguja del calibre 18 como varilla intramedular. Es necesaria cierta fuerza, pero no resuena ninguno de los huesos en la medida en que se fracture la corteza.

Según sea necesario, retire la aguja y úsela a una longitud inadecuada para que ambos huesos encajen suavemente sobre la aguja sin que se muestre una aguja entre el hueso. Coloque un pequeño soporte como una almohadilla de gasa o una pequeña roca o arcilla de modelado debajo de la extremidad del donante para mantenerla fuera de la tensión. Reapproxima los grupos musculares ventrales con ocho a 10 suturas simples interrumpidas de 5-0 poliglactitina para que el injerto no gire alrededor de la aguja del fémur.

Esto le da a la extremidad estabilidad para las anastomosas. Ahora comienza las anastomosas. Irrigar periódicamente el injerto y el campo quirúrgico con solución salina helada para una mejor visualización y reducir la lesión por reperfusión isquémica.

Alinee las arterias femorales y la anastomose del donante y receptor de extremo a extremo usando una sutura de nylon simple interrumpida 10-0, evitando tanto la tensión como el bucle. La arteria requiere un promedio de seis suturas. Al igual que la arteria, anastomose el donante y las venas femorales receptoras de extremo a extremo.

La vena requiere de seis a ocho suturas. El generoso riego salino frío, la técnica de manejo atraumático de los recipientes y dejar colas largas para servir como suturas de perduramiento para la retracción de los recipientes son herramientas importantes para las anastomosas microquirúrgicas efectivas. Coloque una cantidad moderada de polvo de celulosa hemostática en ambas análisismosas, y posteriormente retire las abrazaderas de bulldog microquirúrgicas proximales en la vena y la arteria.

Inspeccione ambas anastomosas para obtener una buena patencia y flujo. Use palitos de algodón para prodifiquen suavemente la vena e inspeccione la buena hemostasia en ambas anastomosas. Cuando ambas anastomosas se confirmen satisfactorias, recorte cualquier cola de sutura de larga duración restante para que coincida con las demás.

Reposicionar la rata a la posición de decúbito lateral izquierdo, utilizar electrocauterización liberal para lograr la hemostasia meticulosa de cualquier sangrado muscular de reperfusión. La atención se vuelve a las anastomosas nerviosas una vez que la hemostasia muscular está asegurada. Reapproxima los grupos musculares dorsales que se encuentran directamente debajo del nervio ciático con simples suturas de poliglactin interrumpidas de 5-0.

Recorta los extremos de corte nervioso que parezcan desiguales. Reapproxima el nervio ciático con 10-0 suturas de nylon que luchan por mordeduras epinales. Ocho a 10 suturas interrumpidas simples generalmente serán suficientes.

Reapproxima los grupos musculares dorsales restantes con suturas de 5-0 poliglactin. A continuación, cierre la piel dorsal con 4-0 de sutura de funcionamiento continuo de poliglactitina. Reposicionando la rata a la posición supina, reaproxima el nervio femoral con sutura de nylon 10-0, de nuevo, luchando por mordeduras epiniales.

Dos o tres suturas interrumpidas simples generalmente serán suficientes. Cierre la piel ventral restante de la misma manera que la piel dorsal. Evite el exceso de cola de sutura, que puede ser irritante para la rata una vez despierto.

Una vez que los animales están fuera de la ventana postoperatoria inmediata, se pueden probar para la recuperación del neuromotor. La prueba de Hargreaves se utiliza para probar la sensación térmica. Coloque la rata en el recipiente de prueba y permita que se aclimate durante 20 minutos.

El vidrio del aparato se confirma limpio, y se confirma que la fuente de calor está trabajando con el dedo del investigador. Antes de realizar la prueba, confirme que la rata está despierta y que la pata probada se coloca sobre el detector de movimiento infrarrojo. Transmitir energía térmica a nivel de intensidad 90.

Se registra el retardo de tiempo en el que el animal aleja su pata de la fuente de calor. Si no se produce ningún movimiento en 20 segundos, la prueba se aborta para evitar lesiones. Obtenga cinco ensayos por extremidad probada, excluyendo el valor más alto y más bajo antes de calcular el tiempo medio de latencia de retirada para cada animal.

Aquí se muestra el diseño operativo en formato de dibujos animados. La extremidad posterior derecha de las ratas donantes y receptoras se amputan a nivel medio del muslo como sección transversal ciática. La arteria femoral, la vena y el nervio, así como el nervio ciático y el hueso del fémur deben reconectarse en la cirugía del receptor.

El modelo se puede utilizar para mostrar efectos diferenciales de supervivencia de la supresión inmune y la estrategia de trasplante. Con esta técnica, la supervivencia a largo plazo es alcanzable. El modelo se puede utilizar para investigar la recuperación del nervio sensorial, que puede ser evidente por cuatro semanas después de la postoperatoria.

La función del motor también se puede interrogar utilizando una plataforma de análisis de marcha. Aquí, hemos presentado una plataforma modelo de rata con características de supervivencia favorables, que utilizamos para sondear la recuperación sensorial y motora como se ve en las cifras de procedimiento. El trasplante de extremidades en la categoría más amplia de VCA, el alostrasplante de componentes vascularizados tiene una promesa terapéutica ampliamente aplicable que aún no se ha cumplido.

Los principales obstáculos alinean las técnicas actuales de inmunosupresión y recuperación neuromotora. El desarrollo de nuevas técnicas dependerá del modelado animal flexible, robusto y reproducible. Usando esta plataforma, esperamos que los investigadores puedan avanzar múltiples facetas del trasplante de extremidades.

Gracias por mirar y buena suerte en sus próximos pasos.