Dando o próximo passo: um modelo de transplante ortotópico ortotópico de coaptation ortotópico para maximizar a recuperação funcional em ratos

Este vídeo fornecerá uma descrição detalhada, como realizar um membro traseiro direito ortotópico, rato transplantado de coxa média. O membro traseiro direito do doador é amputado no nível médio da coxa, depois armazenado no gelo. O membro traseiro direito do rato receptor também é amputado no nível médio da coxa.

O membro do rato doador é então anexado ao rato receptor. Descreveremos como recolocar os sistemas ósseo, artéria, veia, nervo, músculo e pele. O transplante de membros, mais especificamente, alotransplante composto vascularizado, VCA, tem ampla promessa terapêutica.

Mas atualmente é limitado por técnicas, imunossupressão e má recuperação neuromotora funcional. Nosso modelo enfatiza técnicas microcirúrgicas meticulosas testadas pelo tempo, como anastomose vascular costurada à mão e coaptação neural. Realizamos mais de 200 cirurgias em mais de um ano.

Embora haja uma curva inicial de aprendizado para o microcirurgião inicial, usando este vídeo para aprender nosso método e seu compromisso com a prática dedicada, qualquer microcirúrgico será capaz de dominar este modelo. Todos os experimentos foram realizados de acordo com o guia de cuidado e uso de animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde, NIH, e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade northwestern. Os procedimentos específicos foram realizados em um protocolo IS 00001663.

Selecione um rato de oito a 16 semanas de idade pesando entre 250 e 400 gramas no momento da cirurgia. Induzir anestesia geral com isoflurane de 5% através de um vaporizador antes de aparar a pele do membro traseiro do rato. Usar um cone de nariz para manter a anestesia entre dois a 2,5% posicione o rato na placa de operação com um aquecedor por baixo.

Desinfete a pele sem pelos com 70% de álcool esfregando e proteja o campo cirúrgico com gaze estéril. Usando um microscópio microcirúrgico apropriado e os instrumentos microcirúrgicos aqui mostrados, juntamente com eletrocauteria bipolar e monopolar de fácil acesso, você estará pronto para iniciar a dissecção. Use uma tesoura para fazer uma incisão circunferencial e da pele ao redor do membro traseiro direito.

Comece no vinco inguinal imediatamente no mesmo nível do ligamento inguinal e estenda lateralmente dorso para completar a incisão circunferencial. E então expor a camada muscular diretamente abaixo da incisão, dissecar e cauterizar os vasos epigástricos superficiais, que levam da camada muscular ao retalho da pele proximal apenas criado. Reflita o retalho proximal superomedialmente ao ligamento inguinal e o retalho da pele distal inferolateramente ao joelho.

Use um retrátil de arame ou gaze enrolada para ajudar a expor o campo. Observou-se que a anatomia inguinal do rato é semelhante aos humanos;do lado ao medial reside o nervo, artéria e veia. Disseque o nervo femoral, divida-o bruscamente no ligamento inguinal proximal à bifurcação, se possível.

Retraia o nervo dividido inferiormente, mantendo-o seguro fora do caminho, coberto sob gaze úmida. Voltando a atenção para a artéria femoral e a veia usar laços de seda de 7 a 0 de quatro centímetros de comprimento para retrair atraumaticamente os vasos em vez de manuseá-los diretamente. Prestar muita atenção agora vai melhorar seu resultado anastomótico final.

Ligate todos os ramos dos vasos femorais com laços de seda 7-0. Divida os galhos entre os laços. Ramos arteriais e venosos que requerem divisão incluem o ilílico circunflexo superficial e os vasos musculares.

O ilííaco circunflexo superficial é geralmente maior e parece mergulhar fundo como seria o fémoral profundo em humanos, mas o profundo está ausente no rato. Mais ramos distais dos vasos femorais, como o mais alto genicular e o ramo safeno não costumam exigir divisão. Agora liga a artéria femoral com laços de seda 7-0 tão proximal ao ligamento inguinal quanto possível e divida entre os laços.

Semelhante à artéria, liga e divida a veia femoral. Reflita tanto a artéria quanto a veia inferiormente, com segurança para fora do caminho, cobertas sob gaze úmida junto com o nervo femoral coberto anteriormente. Disseca os grupos musculares ventrais, tomando o cuidado de cauterizar qualquer vaso visível que surgir.

A atenção à hemostasia agora minimizará a perda de sangue do receptor durante a reprofusão mais tarde. Profundo aos grupos musculares ventrais, identifique e divida bruscamente o nervo ciático proximal aos seus ramos. Todos os três ramos ciáticos são geralmente visíveis, tibiais, peroneais e sural.

Todos os três devem ser preservados no membro doador. Um quarto ramo cutâneo não é tipicamente visto nesta dissecação. Finalize dividindo os restantes grupos musculares ventral e dorsal no nível médio da coxa com hemostasia meticulosa.

Pode ser necessário retrair o membro medialmente para completar a divisão dos músculos. Transecte o osso do fêmur no meio do eixo usando uma serra rotativa sem fio portátil. O membro está livre do doador.

Tendo removido o enxerto de membro do doador, cortou as pontas amarradas de seda da artéria femoral do lado do enxerto e tocos de veia, reabrindo assim os vasos. Insira um angiocateter de 24 bitolas no toco da artéria do enxerto e lave o enxerto com 250 unidades internacionais de heparina diluída em 5 mililitros de soro fisiológico normal, tendo o cuidado de vê-lo fluir para fora da veia aberta. Lentamente, dou descarga suavemente do enxerto por cerca de três minutos.

O excesso de descarga forte pode danificar o endotélio. Coloque o enxerto em um prato salino refrigerado aninhado em um balde de gelo até o transplante. Eutanize o rato doador com toracotomia bilateral.

A cirurgia do receptor começa semelhante à cirurgia do doador, anestesiando o rato, aparando a pele, fazendo uma incisão circunferencial no vinco inguinal, refletindo os retalhos da pele, dissecando o nervo femoral, artéria e veia. E ligando os mesmos navios de ramo descritos anteriormente. No entanto, durante esta operação, divida o nervo femoral mais distally do que para o doador, mas proximalmente à bifurcação, se possível.

Divida e liberte a artéria femoral e a veia e fixa-as, respectivamente, ao nível do ligamento inguinal com grampos de buldogue microcirúrgico. Continue a cirurgia como descrito anteriormente, dividindo os músculos de endosso ventral da coxa no nível médio da coxa com hemostasia meticulosa, enquanto retrai o membro mediadamente conforme necessário. Identifique e divida o nervo ciático proximal até o ponto de ramificação e transecte o fêmur no eixo médio usando a serra rotativa.

Remova o membro traseiro direito nativo do receptor e elimine adequadamente de acordo com as diretrizes locais do Comitê de Cuidados e Uso de Animais. É muito importante nesta fase baixar o isoflurane para um a 1,5% através do cone do nariz. Muita anestesia durante esta parte menos dolorosa do procedimento levará à morte do rato.

É hora de coapt os ossos juntos. Usando a serra rotativa portátil, raspe todas as irregularidades tanto das extremidades do corte do doador quanto do fêmur receptor. Corte a extremidade do cubo de uma agulha calibre 18, que se tornará a haste intramedusa do fêmur.

Antes de manipular o osso, aplique uma pequena quantidade de cera óssea na extremidade do osso do fêmur para reduzir o sangramento da medula durante o processo de reaming. Coapt o doador e receptor ossos femorais usando a agulha de calibre 18 como uma haste intramedusária. Alguma força é necessária, mas não resma nenhum dos ossos até a fratura do córtex.

Conforme necessário, remova a agulha e corte-a até o comprimento inadequado para que ambos os ossos se encaixem suavemente sobre a agulha sem nenhuma agulha mostrando entre o osso. Coloque um pequeno suporte, como uma almofada de gaze ou uma pequena rocha ou argila modeladora sob o membro doador para mantê-lo fora da tensão. Reaproximar os grupos musculares ventrais com oito a 10 suturas simples interrompidas 5-0 de poliglactina para que o enxerto não gire ao redor da agulha do fêmur.

Isso dá estabilidade ao membro para os anastomoses. Agora comecem os anastomoses. Irrigar periodicamente o enxerto e o campo cirúrgico com soro fisiológico para melhor visualização e para reduzir a lesão isquêmica de reperfusão.

Alinhe as artérias femorais doadoras e receptoras e a anastomose de ponta a ponta usando sutura de nylon 10-0 interrompida simples, evitando tanto tensão quanto looping. A artéria requer uma média de seis suturas. Semelhante à artéria, anastomose as veias femorais do doador e receptor de ponta a ponta.

A veia requer seis a oito suturas. A generosa irrigação salina fria, a técnica de manuseio de vasos atrauáticos e deixar caudas longas para servir como suturas de permanência para retração de vasos são ferramentas importantes para anastomoses microcirúrgicos eficazes. Coloque uma quantidade moderada de pó de celulose hemostática em ambos os anastomoses e, posteriormente, remova os grampos microcirúrgicos proximais na veia e na artéria.

Inspecione ambos os anastomoses para obter boa patência e fluxo. Use penurinhas para cutucar suavemente a veia e inspecione uma boa hemostasia em ambos os anastomoses. Quando ambas as anastomoses forem confirmadas satisfatórias, corte todas as caudas de sutura de longa permanência restantes para combinar com as outras.

Reposicionando o rato para a posição de decúbito lateral esquerdo, use eletrocauteria liberal para atingir hemostasia meticulosa de qualquer sangramento muscular de reperfusão. A atenção é voltada para os anastomoses nervosos uma vez que a hemostasia muscular é assegurada. Reaproximar os grupos musculares dorsais que estão diretamente sob o nervo ciático com simples suturas de poliglactina interrompidas 5-0.

Corte para trás quaisquer extremidades de corte nervoso que pareçam irregulares. Reaproximar o nervo ciático com suturas de nylon 10-0 lutando por mordidas epineural. Oito a 10 suturas simples interrompidas geralmente serão suficientes.

Reaproximar os restantes grupos musculares dorsais com suturas de poliglactina 5-0. Em seguida, feche a pele dorsal com 4-0 de poliglactina contínua. Reposicionando o rato para a posição supina, reaproximar o nervo femoral com sutura de nylon 10-0, novamente, lutando por mordidas perinésais.

Duas a três simples suturas interrompidas geralmente serão suficientes. Feche a pele ventral restante da mesma forma que a pele dorsal. Evite o excesso de sutura, o que pode ser irritante para o rato uma vez acordado.

Uma vez que os animais estão fora da janela pós-operatória imediata, eles podem ser testados para recuperação neuromotora. O teste hargreaves é usado para testar a sensação térmica. Coloque o rato no recipiente de teste e permitiu que ele se aclimatasse por 20 minutos.

O vidro do aparelho está confirmado limpo, e a fonte de calor está confirmada para trabalhar com o dedo do investigador. Antes do teste, confirme que o rato está acordado e a pata testada está posicionada sobre o detector de movimento infravermelho. Transmita energia térmica no nível de intensidade 90.

O atraso de tempo no animal que afasta a pata da fonte de calor é registrado. Se não ocorrer movimento dentro de 20 segundos, o teste é abortado para evitar lesões. Obtenha cinco ensaios por membro testado, excluindo o maior e menor valor antes de calcular o tempo médio de latência de retirada para cada animal.

Aqui está o design operacional retratado em formato de desenho animado. O membro traseiro direito de ambos os ratos doadores e receptores são amputados no nível médio da coxa como seção transversal ciática. A artéria femoral, a veia e o nervo, bem como o nervo ciático e o osso do fêmur devem então ser reconectados na cirurgia do receptor.

O modelo pode ser usado para mostrar efeitos diferenciais de sobrevivência da supressão imunológica e estratégia de transplante. Com essa técnica, a sobrevivência a longo prazo é alcançável. O modelo pode ser usado para investigar a recuperação sensorial do nervo, que pode ser evidente por quatro semanas após o operatório.

A função motora também pode ser interrogada usando uma plataforma de análise de marcha. Aqui, apresentamos uma plataforma modelo de rato com características de sobrevivência favoráveis, que usamos para sondar a recuperação sensorial e motora, como visto nos números de processo. Transplante de membros sob a categoria mais ampla de VCA, a alotransplante de componentes vascularizados tem uma promessa terapêutica amplamente aplicável ainda não foi cumprida.

Os principais bloqueios alinham as técnicas de imunossupressão e recuperação neuromotor. O desenvolvimento de novas técnicas dependerá de modelagem animal flexível, robusta e reprodutível. Usando esta plataforma, esperamos que os investigadores sejam capazes de avançar múltiplas facetas do transplante de membros.

Obrigado por assistir e boa sorte em seus próximos passos.