Probenahme und Analyse von Tierischen Duftsignalen

Die Rolle, die Geruch in der Tierkommunikation spielt, wird derzeit unterschätzt und daher wenig untersucht. Insbesondere über die chemischen Veränderungen, die den olfaktorischen Signalen bei Tieren, einschließlich Menschen, zugrunde liegen, ist sehr wenig bekannt. Und diese sind auch auf methodische Herausforderungen zurückzuführen, die Erfassung und Quantifizierung chemischer Verbindungen von Gerüchen, die von Tieren zur Kommunikation verwendet werden.

Bei der Arbeit mit hochkomplexen chemischen Gemischen gibt es mehrere potenzielle Herausforderungen, darunter auch bei der Probenahme und Analyse der Geruchsproben. Wir führen die Analyse von Gerüchen durch, die von Tieren verwendet werden, um zu verstehen, wie sie von ihnen verwendet werden können, wenn sie miteinander kommunizieren. Wir kombinierten Zytochemie mit Bioökologie Endokrinologie und Zytologie, um unser Verständnis der Rolle des Geruchs in der Tierkommunikation zu verbessern.

Für unsere aktuelle Methodik in Wolverhampton haben wir die Technik der Headspace-Festphasenmikrostruktur in Verbindung mit der Gaschromatographie-Massenspektrometrie übernommen, die auf der in der Vergangenheit verwendeten Methodik aufbaut und eine unsichtbare Methodik verwendet. Probengerüche werden auf eine der folgenden Arten gesammelt. Eine, spontan freigesetzte Probengerüche von gewöhnungsmäßigen Studienteilnehmern.

Zum Beispiel sammeln Zooprimaten Duftdrüsengeruchssekrete durch Duftmarkierung auf Sterilem Filterpapier oder Urinproben direkt in Fläschchen. Zweitens, nach dem Training sammeln studienteilnehmer durch die Verwendung von positiver Verstärkung Geruchssekrete, indem sie Duftblick mit sterilen Wattestäbchen reiben. Drittens sammeln die Probanden nach der Sedierung der Studienteilnehmer Geruchssekrete, indem sie Duftdrüsen mit sterilen Wattestäbchen reiben, durch Proben in sterile 10-Milliliter-Schraubverschlüsse, Klarglasfläschchen und Dichtung mit Schraubverschlüssen mit P T F E Silikonsektor.

Lagern Sie die Fläschchen sofort bei minus 20 Grad Celsius. Beachten Sie, dass es wichtig ist, dass während der Probenahme saubere persönliche Schutzausrüstung wie Nitrilhandschuhe verwendet wird. Wechselhandschuhe vermeiden häufig den direkten Hautkontakt mit Proben und Fläschchen.

Es wird bevorzugt, brandneue Fläschchen zu verwenden. Im Falle von gebrauchten Fläschchen ist es jedoch wichtig, die Durchstechflaschen vorzureinigen und dann das gleiche Protokoll zu verwenden. Nehmen Sie jedes Mal, wenn Duftmarken gesammelt werden, Umweltrohlinge.

Setzen Sie dazu während der Probenahme ein unbenutztes Filterpapier oder Wattestäbchen und Fläschchen der Umwelt aus. Proben werden im Feld vorbereitet. Für ein duftendes Filterpapier schneiden Sie ein ca. 10 Millimeter Quadrat aus dem Papier und legen Sie es in eine 10 Milliliter Schraubenkopfraumfläschchen.

Für einen Tupfer den Tupferkopf ganz am Ende des Tupferschaftes abschneiden und in eine Kopfraumfläschchen legen. Nachdem jede Probe vorbereitet wurde, entsorgen oder reinigen Sie die Klinge, um die Probenahmemedien mit einem geeigneten antibakteriellen Tuch und/oder Alkohol zu schneiden und trocknen Sie gründlich ab. Lagern Sie alle Proben bei minus 20 Grad Celsius.

Beachten Sie, dass Proben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden sollten, aber im Feldlager bei der niedrigsten Temperatur möglich ist und so kurz wie möglich auf minus 20 Grad Celsius übertragen wird. Vor der Analyse die Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und mindestens eine Stunde lang auf natürliche Weise auf Raumtemperatur laufen lassen. Richten Sie die Analysemethoden auf dem GCMS wie folgt für SPMS-Analysebedingungen ein, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um SBME-Fasern vor der ersten Verwendung zu konditionieren.

Es ist wichtig, dass die SBME-Baugruppe korrekt im Automatisch-Probenehmer installiert ist und dass sie auf die Faserkonditionierungseinheit und den GC-Einlassanschluss ausgerichtet ist. Eine falsche Ausrichtung kann zu einer Beschädigung oder Zerstörung der Sbme-Faser führen. Stellen Sie sicher, dass die Barschgaszufuhr zur Faserkonditionierungseinheit eingeschaltet ist.

Um die Konsistenz zwischen den Probenaufbewahrungszeiten zu verbessern, ist die Analysemethode die Verweilzeit gesperrt, fügen Sie die Probenfläschchen in das Auto-Sampler-Tray ein leeres Kopfraum-Fläschchen ein, um als Systemrohling in der ersten Position des Auto-Sampler-Trays zu fungieren. Platzieren Sie den Umgebungsrohling an der zweiten Position und legen Sie dann alle verbleibenden Proben für die Analyse in die nachfolgenden Positionen des automatischen Probenahmefachs. Erstellen Sie eine Analysesequenz, um jede Probe innerhalb des Probenfachs zu analysieren.

Wählen Sie auf dem Startbildschirm des Massenjägers die Sequenz für die Menüleiste aus und laden Sie dann die Sequenz aus dem Dropdown-Menü. Eine leere Sequenztabelle wird angezeigt, um die Sequenztabelle für alle Leerzeichen und Samples zu vervollständigen, indem die entsprechenden Informationen als abgeschlossene Sequenztabelle gespeichert werden. Beachten Sie, dass die genauen Informationen für die Sequenztabelle von der Formatierung der Tabelle durch die Laboratorien abhängen.

Zu den Mindestinformationen gehören normalerweise der Beispieltypname, der Dateispeicherort und die Anzahl der Analysemethode sowie der Speicherort der Datendatei sowie die Namenszuweisung eines Datendateinamens, der mit dem Beispielnamen bei der zukünftigen Datenverarbeitung übereinstimmt. Während der Analyse können weitere Proben zur Sequenz hinzugefügt werden. Führen Sie die Sequenz aus, indem Sie sequenz aus der Menüleiste auswählen, und führen Sie dann sequenz aus.

Nach der Analyse wurden die Proben so schnell wie möglich in den Gefrierschrank zurückgebracht. Beachten Sie, dass es möglich sein kann, Proben erneut zu untersuchen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass einige flüchtige Komponenten während der ersten Analyse vollständig extrahiert wurden und einige Verbindungen bei 40 Grad Celsius einer thermischen und bakteriellen Zersetzung unterzogen worden sein können.

Daher ist das Ergebnis im Chromatogramm möglicherweise nicht vollständig repräsentativ für die ursprüngliche Duftmarkierung. Die anfängliche Datenanalyse umfasst die Integration von Chromatogrammen, um Retentionszeit- und Peak-Flächendaten zu erhalten, zusammen mit der vorläufigen Identifizierung von Peaks mit Cam-Station-Software und Nest-Massenspektraldatenbanken. Die Datenanalyse kann entweder manuell oder durch eine halbautomatische Methode durchgeführt werden.

Wenn die halbautomatische Methode verwendet wird, ist es manchmal von Vorteil, ein gewisses Maß an manueller Datenanalyse durchzuführen, um vorläufige Identifizierungen zu überprüfen. Um die Datenanalyse zu starten, öffnen Sie die Datendatei, indem Sie in der linken Navigationsleiste auf die entsprechende Datei klicken. Das Gesamtionenchromatogramm TIC wird im oberen Fenster des Datenanalysebildschirms angezeigt.

Um den TIC mit dem RTE-Integrator zu integrieren, wählen Sie zuerst Chromatogramm aus der Menüleiste und dann Integrator aus dem Dropdown-Menü, ein Popup-Fenster öffnet sich und wählen Sie den RTE-Integrator aus. Gehen Sie zurück zum Chromatogramm-Menü und wählen Sie nun Integrieren. Um die Integrationsparameter so anzupassen, dass Spitzen oder mehr als das Dreifache des Basislinienrauschens integriert sind, wählen Sie erneut Chromatogramm aus der Menüleiste und dann MS Signal-Integrationsparameter aus dem Dropdown-Menü.

Passen Sie im Popup-Feld die minimale Spitzenfläche entsprechend an 1.0 führt in unseren Beispielen zu akzeptablen Ergebnissen. Um Spitzen zu identifizieren und einen Zusammenfassendbericht zu generieren, wählen Sie Berichte aus der Menüleiste exportieren und dann Den Bericht über die Suchergebnisse in XLS mit Bibliothek aus. Beachten Sie, dass die zu durchsuchenden Spektralbibliotheken zusammen mit der Anzahl der anzuzeigenden Bibliotheksabweichungsabweichung in der Software voreingestellt werden müssen, bevor eine Bibliothekssuche durchgeführt werden kann.

Der resultierende Tabellenkalkulationsbericht enthält Integrationsdaten für jeden Peak und eine vorläufige Spektralbibliothekszuordnung zur Zuweisung der Identität. In der Regel sollte die Bibliotheksqualität oder Bibliothekskennung größer als 80 sein, um die vorläufige Identifizierung zu akzeptieren. Speichern Sie die Tabelle.

Um einen Peak direkt aus dem TIC zu identifizieren, wählen Sie den Peak of Interest aus. Wenn der Peak klein ist, zoomen Sie hinein, indem Sie ein Feld um den Peak zeichnen, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten, strecken Sie das Feld über den Peak und lassen Sie die Maustaste los. Platzieren Sie die Cursorlinie so, dass sie sich am höchsten Punkt des Gipfels oder kurz danach befindet.

Doppelklicken Sie, die rechte Maustaste und das Massenspektrum für den Peak erscheinen im unteren Fenster des Datenanalysebildschirms. Um eine Spektralbibliothek zu durchsuchen, bewegen Sie den Cursor an eine beliebige Stelle im Spektralfenster und doppelklicken Sie mit der rechten Maustaste, die Suchergebnisse der Bibliothek werden in einem neuen Fenster angezeigt. Um zuerst das Hintergrundrauschen aus einem Interessierensbereich zu entfernen, doppelklicken Sie mit der rechten Maustaste auf den betreffenden Peak und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste in einem Bereich ohne Peaks unmittelbar vor dem Peak of Interest auf die Schaltfläche Subtrahieren im Menüband oder wählen Sie Chromatogramm für die Menüleiste und subtrahieren Sie dann Spektren aus dem Dropdown-Menü.

Das subtrahierte Spektrum wird im unteren Fenster des Datenanalysebildschirms angezeigt und zeigt einen Bindestrich neben den Scandaten in der Fensterüberschrift an. Nach diesem Protokoll identifizierten wir vorläufig insgesamt 32 flüchtige chemische Verbindungen aus der Analyse von 14 genitalen Duftmarken, die spontan von roten Rüschenmakis auf Filterpapier freigesetzt wurden, und verglichen Geruchsprofile mit Merkmalen des Signalgebers, die natürlich vorkommende flüchtige Verbindungen wie Kohlenwasserstoffe, Terpene, Turpinalkohole und Ketone in diesen Profilen vorhanden waren und die Verbindungen enthalten, die zuvor als Sexualhormone und Hinweise auf die Fitness gefunden worden waren. bei anderen Tierarten. Die Verbindungen, die vorläufig identifiziert wurden, sind in Tabelle eins aufgeführt.

Repräsentative Chromatogramme, eines von einer Kontrolle und eines von einer Lima-Duftmarke, sind in Abbildung eins dargestellt. Die Anzahl und relative Häufigkeit der Komponenten variierte von Probe zu Probe bei verschiedenen Studienteilnehmern. In allen Proben waren jedoch sechs Verbindungen mit der Bezeichnung A bis F auf dem Chromatogramm vorhanden.

Diese Verbindungen wurden jeweils auf Höhe zu E's Insel ein hexanaler Parakristall sechs Paramentha zwei acht Farbstoff eins zwei Pinen vier und Pentodecan gebogen. Die Ergebnisse dieser Studie deuteten darauf hin, dass rote Rüschenmakis gesendete Markierungen verwenden, um Informationen über Geschlecht und weibliches Alter zu vermitteln, wobei eine genitale Markierung keine Rolle bei der soziosexuellen Kommunikation spielt. Ein weiteres repräsentatives Ergebnis nach der Verwendung dieses Protokolls war unsere Studie zur Fruchtbarkeitswerbung durch weibliche Olivenpaviane.

Wir identifizierten insgesamt 74 flüchtige Verbindungen aus der Analyse von 395 weiblichen Pavian-Vaginalgeruchsproben. Dazu gehörten eine Reihe von natürlich vorkommenden geruchsintensiven flüchtigen Verbindungen wie Ketone, Alkohole, Aldehyde, Terpene, flüchtige Fettsäuren und Kohlenwasserstoffe. Typische Chromatogramme, die verwendet werden, um leere Troll- und weibliche Pavian-Vaginalgeruchsproben aus fruchtbaren und nicht fruchtbaren Perioden zu vergleichen, sind in Abbildung zwei dargestellt.

Wir untersuchen die Zusammenhänge zwischen vaginalen Geruchsprofilen und sexueller Empfänglichkeit weiblicher Paviane. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich die Gesamtmenge des vaginalen Geruchs mit der Fruchtbarkeit unterscheidet, was darauf hindeutet, dass der Geruch eine Rolle bei der Signalisierung der weiblichen Pavianfruchtbarkeit spielen könnte. Wir fanden auch Unterschiede im vaginalen Geruch zwischen Gruppentypen, aber wir konnten die Auswirkungen der Gruppenzusammensetzung, der weiblichen Altersaltersgleichheit nicht unterscheiden.

Es sind die kombinierten Vorteile der Probenahme und Verwendung des GCMS. Die Verwendung der Festphasen-Mikroextraktion im Kopfraum ermöglicht es also, eine breite Palette verschiedener Proben mit GCMS zu analysieren. Wir sind in der Lage, die Komponenten dieser komplexen Markierungen zu trennen und dann jede dieser einzelnen Komponenten mit dem Massenspektrometer zu identifizieren.

Und dann, so ist die ganze kombinierte Technik sehr leistungsfähig und gibt uns viele Informationen über diese Duftmarkierungen, die in der Vergangenheit eine Menge Probenvorbereitungsextraktion erforderlich gewesen wären, um die Ergebnisse zu erhalten.