Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch ein Stuart HQ &amp; Victoria Quan Promotionsstipendium (RMW), NIH Pioneer Award (RAS) unterstützt

General Health Exam Eine umfassendere Behandlung der allgemeinen Gesundheit Prüfungen in ausgezeichneten Verhaltens Jacqueline Crawleys Phänotypisierung Ressource gefunden werden kann, ist, was mit meiner Maus Wrong? 1. Wir ersten Einsatz einer modifizierten Beobachtungsstudien Testbatterie zur allgemeinen Gesundheit des Patienten zu beurteilen. Die Batterie enthält Elemente aus umfassende Beurteilung Samuel Irwins Protokoll 2 schnell zu identifizieren jene Themen, die als ungeeignet für die weitere Erprobung wird. In kurzen, identifiziert die modifizierte Batterie Tiere, die körperlich nicht normal sind (z. B. stark unter-oder übergewichtig, schlecht gepflegt, Dyspnoe) oder weisen abnormale Körperhaltung, Fortbewegung oder Verhaltensweisen. Diese konnten alle Erscheinungsformen der Krankheit sein. Jede erste Auswertung, die ähnlich identifiziert ungesunde Themen angemessen ist. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Tiere tierschutzgerecht beide sind während der allgemeinen Gesundheits-Prüfung als auch bei nachfolgenden Tests verwendet. Keine Anästhesie oder Analgesie verwendet wird, wie diese Tests nicht enthalten potenziell schmerzhaften Eingriffen. Olfaktorische Empfindlichkeit Testing Dieser Test wurde entwickelt, um einen Unterschied in der olfaktorischen Empfindlichkeit zwischen zwei Gruppen von Mäusen (zB ein Wildtyp und Mutante Gruppe von Tieren) zu erkennen. In diesem Test werden mehrere Verdünnungen eines Duftes aus. Eine naive Tier untersucht dann einer einzigen Verdünnung von diesem Duft und die gesamte explorative Zeit (max. 3 Minuten) wird aufgezeichnet. Mehrere Verdünnungen der Duft auf unterschiedlichen, naive Versuchspersonen getestet und die gesamte explorative Zeit wird verwendet, um Dosis-Wirkungs-Kurven für jede Gruppe von Mäusen zu erzeugen. Zwei Forscher sollten in der Prüfung beteiligt sein, mit einem Blinden zu unterwerfen Genotypen und / oder Zustand. Primäre Forscher <ol><li> Erhalten vier saubere Käfige (8 H x 10 B x 18 L, in cm), alle ohne Betten. Richten Sie die vier Käfige in der Biosicherheitswerkbank. </li><li> Set up Trennwände zwischen jeder Arena mit einer undurchsichtigen Filterpapier. Legen Sie ein schwarzes Plakat Bord über die endgültige Teilung, so dass die schwarze Seite Zeilen der Seite und Boden des Käfigs. Decken Sie die Oberseite der Arena mit einem klaren Stück Plexiglas, damit Licht in die Arena zu beleuchten. (A) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_8/figure1new.png" alt="Abbildung 1" /> (B) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_9/image15.png" alt="Abbildung 1.5" /> Abbildung 1. Arena Set-Up. (A) Richtig drapiert, leere arena (b) Arena mit dem Betreff und duftende Filterpapier. </li> <li> Begin Gewöhnung der Probanden. Legen Sie das erste Thema in der ersten Käfig für Gewöhnung. Nach 15 Minuten bewegen das erste Thema auf den zweiten Käfig. Reinigen Sie die erste Käfig mit Quatricide TB. Als nächstes legen Sie das zweite Thema in der ersten, gereinigt Käfig. Setzen Sie diesen Vorgang mit anschließender Themen. Letztlich sollte jeder Gegenstand in allen drei Käfigen, bevor sie in die Arena (vierte und letzte Käfig) für weitere 15 Minuten der Gewöhnung vor der Prüfung gelegt gewöhnt werden. </li></ol> Blinde Forscher <ol><li> Machen Sie eine entsprechende Anzahl von 2 Zoll um 2 cm große Quadrate aus Filterpapier für Duftproben. </li><li> Mit den vorab ausgewählten Duft, entsprechend verdünnen. Für hydrophobe Proben wie Erdnussbutter, mit Öl als Lösungsmittel, für alle anderen, destilliertes Wasser verwenden. Vortex. </li><li> Legen Sie eine digitale Video-Aufnahmegerät am anderen Ende der Biosicherheitswerkbank so dass der gesamte Käfig Ende im Fokus ist. Werfen Sie einen vorläufigen Video, um sicherzustellen, Parameter sind ausreichend. </li><li> Notieren Sie die Reihenfolge, in der Verdünnungen getestet werden darauf achten, dass die Reihenfolge der Versuche zufällig. </li><li> Rekord Thema Wurf und Identifikationsnummern. </li><li> Sobald das Motiv für 15 Minuten in der Arena gewöhnt, beginnen Vorbereitung für den ersten Versuch. Pipette die erste Verdünnung nach oben und unten in den konischen Rohr vor dem Pipettieren sie auf ein Filterpapier entfernt. Das Filterpapier Oberfläche sollte optimal ~ 85% fallen (etwa 0,50 ml Lösung). Verwenden Sie einen Kimwipe um sicherzustellen, dass das Filterpapier nicht übermäßig gesättigt. </li><li> Begin Videoaufnahme. </li><li> Legen Sie das Filterpapier Platz im Käfig auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres die aktuelle Position. </li><li> Beginnen mit der Zeitmessung. </li><li> Nach 3 Minuten, die Aufnahme zu beenden, und entfernen Sie das verdünnte Duft. </li><li> Wenn nur ein Duft (zB Zimt) getestet werden soll, entfernen Sie die erste Testperson aus der Arena. Wiederholen Sie die Schritte 6-11 für jedes Tier, entsprechend Verdünnen der Duft für jedes Thema. Wenn mehr als ein Duft ist zu prüfen, aber nicht entfernen der Proband aus der Arena. Stattdessen beginnen mit der Zeitmessung. </li><li> Passend zu verdünnen den nächsten Duft mit den gleichen Methoden wie oben aufgeführt. </li><li> Nach 1 Minute beginnen Videoaufnahme. Legen Sie das Filterpapier Quadrat mit der Verdünnung der nächsten Duft in den Käfig auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres aktuellen Position. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6-13 jeden Duft, unter Hinweis auf die Video-Datei-Nummer für jeden Versuch. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6-14 jedem Thema. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_10/image2new.png" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für eine Sitzung des olfaktorischen Sensibilität Tests. Jede Maus entweder von der Kontrollgruppe (Gruppe A) oder der experimentellen Gruppe (Gruppe B) wurde zu einem der fünf verschiedenen Verdünnungen von Zimt-Extrakt auf Filterpapier für einen, drei minütigen Sitzung ausgesetzt. Insgesamt benötigte Zeit, erkunden das Filterpapier beurteilt wurde. Mäuse in der Gruppe A haben eine größere olfaktorischen Empfindlichkeit als die in Gruppe B. </li></ol> Olfaktorische Preference Testing Dieser Test wurde entwickelt, um spezifische Detektion Mängel, nämlich die Fähigkeit, attraktive oder aversive Gerüche Sinn zu erkennen. Das folgende Verfahren borgt freizügig aus dem Protokoll der Kobayakawa, K., et al.3. Auch hier sollten zwei Forscher in Tests beteiligt sein, mit einem Blinden zu unterwerfen Genotypen und / oder Zustand. Die gesamte explorative Zeit wieder aufgenommen (auf Video-Anzeigen) für verschiedene Düfte. Diese Düfte mit insgesamt explorative mal größer sind als Wasser, als &quot;attraktiv&quot;, während die mit Zeiten von weniger als Wasser bezeichnet werden &quot;aversive&quot; bezeichnet. Der Forscher dann untersucht, ob die gleichen Düfte &quot;attraktiv&quot; oder &quot;aversive&quot; für verschiedene Testpersonen werden. Bitte folgen Sie den Schritten 1-3 in der olfaktorischen Empfindlichkeit Testabschnitt für den primären Forscher. Blinde Researcher Das Verfahren für die olfaktorischen Präferenz Test ist der gleiche, mit leichten Modifikationen der Schritte 2 und 4. Bitte befolgen Sie die Schritte 1-15 in der olfaktorischen Empfindlichkeit Testabschnitt für Blinde Forscher, mit folgenden Änderungen: Für Schritt 2 mit den vorher ausgewählten Düften (eine Kombination der beiden attraktiven und aversive Düfte), machen entsprechend verdünnten Lösungen von jedem in konischen Rohren. Für hydrophobe Proben wie Erdnussbutter, mit Öl als Lösungsmittel, für alle anderen, destilliertes Wasser verwenden. Vortex. Für Schritt 4, anstatt die Aufnahme der Verdünnung getestet werden, notieren Sie die Reihenfolge der vielfältigen Düfte, die getestet werden, die zufällige Reihenfolge der Versuche. Dieser Test wurde entwickelt, um spezifische Detektion Mängel, nämlich die Fähigkeit, attraktive oder aversive Gerüche Sinn zu erkennen. Das folgende Verfahren borgt freizügig aus dem Protokoll der Kobayakawa, K. et al. 3. Auch hier sollten zwei Forscher in Tests beteiligt sein, mit einem Blinden zu unterwerfen Genotypen und / oder Zustand. Die gesamte explorative Zeit wieder aufgenommen (auf Video-Anzeigen) für verschiedene Düfte. Diese Düfte mit insgesamt explorative mal größer sind als Wasser, als &quot;attraktiv&quot; bezeichnet, während diejenigen mit mal weniger als Wasser bezeichnet werden &quot;aversive&quot;. Der Forscher dann untersucht, ob die gleichen Düfte &quot;attraktiv&quot; oder &quot;aversive&quot; für verschiedene Testpersonen werden. Bitte folgen Sie den Schritten 1-3 in der olfaktorischen Empfindlichkeit Testabschnitt für den primären Forscher. Blinde Researcher Das Verfahren für die olfaktorischen Präferenz Test ist der gleiche, mit leichten Modifikationen der Schritte 2, 4 und 13. Bitte befolgen Sie die Schritte 1-15 in der olfaktorischen Empfindlichkeit Testabschnitt für Blinde Forscher, mit folgenden Änderungen: Für Schritt 2 mit den vorher ausgewählten Düften (eine Kombination der beiden attraktiven und aversive Düfte), machen entsprechend verdünnten Lösungen von jedem in konischen Rohren. Für hydrophobe Proben wie Erdnussbutter, mit Öl als Lösungsmittel, für alle anderen, destilliertes Wasser verwenden. Vortex. Für Schritt 4, anstatt die Aufnahme der Verdünnung getestet werden, notieren Sie die Reihenfolge der vielfältigen Düfte, die getestet werden, die zufällige Reihenfolge, in jedem Versuch. Für den Schritt 13, place des Filterpapiers Platz mit dem nächsten Duft in den Käfig auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres die aktuelle Position. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_11/image3new.png" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für eine Sitzung des olfaktorischen Präferenz Tests. Jede Maus wurde zu jedem der verschiedenen Düften auf Filterpapier für einen, drei minütigen Sitzung ausgesetzt. Insgesamt benötigte Zeit, erkunden das Filterpapier beurteilt wurde. Peanut Butter und Vanille sind attraktive Düfte (explorative Zeit Duft&gt; explorative Zeit Wasser) und 2-Methylbuttersäure ist aversive (explorative Zeit Duft &lt;explorative Zeit Wasser). Scoring der olfaktorischen Tests Nach dem Erwerb aller der olfaktorischen Sensibilität und Präferenz Videos, ist es notwendig, die gesamte Zeit erkunden jeder Verdünnung / Duft zu analysieren. Haben die blinden Forscherin analysiert alle Videos auf Konsistenz. <ol><li> Vorschau video, unter Hinweis auf die folgenden: a) wenn das Filterpapier in die Arena gebracht wird, b) wenn die Maus nähert sich dem Filterpapier, c) wenn die Maus untersucht das Filterpapier und d) wenn 3 Minuten vergangen sind (ab wann der Filter Papier wurde in der Arena). Zu wissen, wann man sich auf das Verhalten der Maus Fokus macht es einfacher, genau Score der gesamten Zeit erkunden bei Durchsicht. </li><li> Überprüfen Sie die Video. Notieren Sie sich die Zeit, wenn der Mauszeiger untersucht das Filterpapier (Latenz). </li><li> Mit einer Stoppuhr, Uhrzeit alle Untersuchungen innerhalb von drei Minuten zu platzieren das Filterpapier in die Arena. Der Zeitpunkt der Untersuchung ist wie jedes Mal, wenn die Maus die Nasenlöcher &lt;1 mm aus dem Filterpapier definiert sind. Es ist wichtig, keine von der Zeit, wenn die Maus in der Nähe des Filterpapier umfassen, ist aber nicht aktiv untersucht es. Verwenden Sie keine Anfälle von Kau-und leckt das Papier oder die Kämpfe des Sitzens auf dem Papier in der gesamten explorativen Zeit. Es ist notwendig, eng und konsequent an diese Regeln genau zu analysieren olfaktorischen Verhalten. </li><li> Rekord Latenzzeit, verbrachte die gesamte Zeit der Untersuchung der Filterpapier-und Video-Datei-Nummer. </li></ol>

<ol>
	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What&amp;rsquo;s+Wrong+with+my+Mouse?+Behavioral+Phenotyping+of+Transgenic+and+Knockout+Mice.">What&amp;rsquo;s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice.</a> , 42-60 (2007).</li><li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+observational+assessment:+Ia.+A+systematic,+quantitative+procedure+for+assessing+the+behavioral+and+physiologic+state+of+the+mouse.">Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.</a> Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).</li><li>Kobayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb.">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450, 503-508 (2007).</li></ol>

Die oben genannten Tests ermöglichen die schnelle und zuverlässige Beurteilung der grundlegenden Riechvermögen. Es ist nicht zu übersehen ist jedoch, dass diese Zuverlässigkeit der richtigen Auswahl und Vorbereitung der Themen für die Prüfung benötigt. Tiere, die krank oder anderweitig behindert sind, sind oft widersprüchlich Probanden. Außerdem ist die Gewöhnung der Probanden Taste. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung von mehreren Käfigen während der Gewöhnung Prozess der Tiere, um sich mit Experi...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methylbutyric acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>W269506</td>
<td>Concentrations Used:9.16 x 10-1 &#x2013; 10-8 M 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pure Vanilla Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Unilever</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Cinnamon Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil, light</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>O121-1</td>
<td>Concentrations Used:N/A</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

olfactory behavioral testing in the adult mouse

Das Nagetier olfaktorischen System ist von zunehmendem Interesse an Wissenschaftler, studierte, zum Teil in der Systembiologie durch seine stereotype, aber zugängliche Schaltungen. Darüber hinaus macht dieses Gebiet die einzigartige Fähigkeit, neue Nervenzellen in einem Organismus zu Lebzeiten generieren zu einem attraktiven System für Entwicklungs-und regenerative Biologen gleichermaßen. Ein solches Interesse erfordert ein Mittel für eine schnelle und gleichzeitig zuverlässige Beurteilung der olfaktorischen Funktion. Viele Tests von olfaktorischen Fähigkeiten sind komplexe, variable oder nicht speziell für Mäuse entwickelt. Auch sind einige Tests empfindlich auf Gedächtnisstörungen sowie Mängel in olfaktorischen Fähigkeiten, verwirrende erzielten Ergebnisse. Hier beschreiben wir eine einfache Reihe von Tests entwickelt, um Defekte im olfaktorischen Sensibilität und Präferenz zu identifizieren. Erstens ermöglicht eine erste allgemeine gesundheitliche Bewertung für die Kennzeichnung von Tieren geeignet für weitere Tests. Zweitens sind die Mäuse zu verschiedenen Verdünnungen von Düften ausgesetzt, um festzustellen, ob es einen Schwellenwert Unterschied. Drittens werden die Mäuse mit verschiedenen Düften, sowohl attraktiv als auch aversive, dass für die Beurteilung der olfaktorischen Präferenz ermöglichen vorgestellt. Diese einfachen Studien sollte die erstmalige Beschreibung der olfaktorischen Verhalten zugänglich für Labore verschiedener Ressourcen und Know-how.

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Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

Fundamental, aber einzigartigen Eigenschaften der Nager olfaktorische System zu ihrer zunehmenden Studie unter Biologen geführt. Eine relativ einfache Beurteilung ihrer Funktion wird dann benötigt. Hier beschreiben wir sensitive Tests zur Charakterisierung von Maus olfaktorischen Sensibilität und Präferenz.

Olfaktorische Behavioral Testing in der adulten Maus

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

olfactory-behavioral-testing-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Aufrufe.  Dana Farber Cancer Institute. Fundamental, aber einzigartigen Eigenschaften der Nager olfaktorische System zu ihrer zunehmenden Studie unter Biologen geführt. Eine relativ einfache Beurteilung ihrer Funktion wird dann benötigt. Hier beschreiben wir sensitive Tests zur Charakterisierung von Maus olfaktorischen Sensibilität und Präferenz.

Serie: Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Forschung

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...