Diese Studie wurde zum Teil durch einen Zuschuss für die wissenschaftliche Forschung des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport und Technologie (18K04843) an Y. Yawata, den JST ERATO (JPMJER1502) an N. Nomura unterstützt.

1. Vorbereitung der Probe
<ol><li>Legen Sie eine 1 mm dicke Silikondichtung mit Vertiefungen auf einen Glasobjektträger.</li>
	<li>Legen Sie eine 1 mm dicke 0,8% (w/v) Agaroseplatte in die Vertiefung der Silikondichtung.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zelldichte einer beliebigen mikrobiellen Zellkultur auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD660) = 1,0.</li>
	<li>Geben Sie eine 5 μL Aliquot Zellsuspension auf die Agaroseplatte.</li>
	<li>Vorsichtig mit einem Glasdeckglas abdecken.</li>
</ol>2. Aufbau eines Mikroskops
HINWEIS: Die CRIF-Technik kombiniert konfokale Reflexionsmikroskopie (CRM) und konfokale Mehrkanal-Mikrospektroskopie. CRM dient als Informationsquelle für die zelluläre Morphologie und räumliche Lokalisierung, die unabhängig von der zellulären angeborenen Fluoreszenz ist. Die konfokale Mehrkanal-Mikrospektroskopie liefert die spektrale Information der zellulären angeborenen Fluoreszenz. Im folgenden Protokoll wird jedes Bild, das mit CRM oder konfokaler Fluoreszenz-Mikrospektroskopie aufgenommen wurde, als CRM-Bild bzw. Mehrkanal-Konfokal-Mikrospektroskopie-Bild bezeichnet.
<ol><li>Schließen Sie ein konfokales Mikroskop mit abgestorbenen Spektralkanälen an eine Photomultiplierröhre (PMT) oder einen GaAsP-Detektor an. HINWEIS: Diese Setups sind von mehreren Herstellern erhältlich.</li>
	<li>Statten Sie das Mikroskop mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) mit ausreichender Vergrößerung aus. HINWEIS: Für die Analyse von Bakterienzellen wird ein 63-faches Objektiv mit NA > 1,4 empfohlen.</li>
	<li>Statten Sie das Mikroskop mit einem Halbreflexionsspiegel (z. B. NT 80/20) aus, um CRM aufzunehmen, das auf der zellulären Streuung des einfallenden Lichts beruht, um die Zellmorphologie zu visualisieren.</li>
	<li>Für die konfokale Mehrkanal-Mikrospektroskopie ist das Mikroskop mit dichroitischen Spiegeln auszustatten. Verwenden Sie beispielsweise MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 oder MBS 488/543/633 für 405, 458, 488, 514, 543 bzw. 633 nm Anregung.</li>
	<li>Stellen Sie die Beleuchtungsstärke für jede Anregungswellenlänge mit einem Laserleistungsmesser ein. Halten Sie die Leistung unter dem Mikroskop durch Anregungswellenlängen konstant (z. B. verwenden Sie 50 μW mit dem 63-fachen Objektiv).</li>
</ol>3. Bildaufnahme
<ol><li>Stellen Sie die Lochgröße mit der Mikroskopsoftware auf 1 AE ein.</li>
	<li>Stellen Sie die Pixelverweilzeit (d. h. die Scangeschwindigkeit) für jede Anregungswellenlänge ein. HINWEIS: Eine zu lange Pixelverweildauer kann Zellen schädigen. Vermeiden Sie übermäßig lange Pixelverweilzeiten, um Fotoschäden an den Zellen zu minimieren. Für Bakterienproben ist normalerweise eine Pixelverweilzeit <55,6 μs/μm2 (wenn die Bestrahlungsstärke unter dem Mikroskop ~17 μW/cm2 beträgt) geeignet, um eine Wachstumshemmung zu vermeiden. Dieser Parameter kann je nach Organismus und Versuchsaufbau variieren.</li>
	<li>Legen Sie die Scanauflösung fest. Verwenden Sie für kleine Zellen wie Bakterien eine Scanfläche von 1.024 x 1.024.</li>
	<li>Stellen Sie den Z-Scanbereich so ein, dass der gewünschte Bereich abgedeckt ist. HINWEIS: Für Bakterien- und Hefezellproben, die auf einer Agaroseplatte verteilt sind, ist in der Regel ein Z-Scanning-Bereich von ~15 μm ausreichend.</li>
	<li>Stellen Sie den entstaubten Detektor so ein, dass er den sichtbaren Wellenlängenbereich erfasst (z. B. 416−691 nm). Verwenden Sie ein Spektralfenster von 8−10 nm.</li>
	<li>Erfassen Sie mehrkanalige konfokale Mikrospektroskopiebilder in einer Sequenz von der längsten bis zur kürzesten Anregungswellenlänge, um Z-Stacks von Fluoreszenzbildern zu erzeugen.</li>
	<li>Erfassen Sie CRM-Bilder.</li>
	<li>Speichern Sie die aufgenommenen Bilder als 16-Bit-TIFF-Dateien in einem Verzeichnis. Benennen Sie die Dateien mit der Namenskonvention XXXcYYzZZ.tif, wobei XXX die Anregungswellenlänge, YY die Detektorkanalnummer, ZZ die Z-Slice-Nummer und "c" und "z" Präfixe für die Detektornummer bzw. die Z-Slice-Nummer sind.<ol>
<li>Wenn beispielsweise ein konfokales Mehrkanal-Mikrospektroskopiebild mit einer Anregungswellenlänge von 405 nm, dem 1. Detektorkanal des Detektorarrays, aufgenommen wird und der 5. Schnitt des Z-Stacks ist, nennen Sie ihn "405c01z05.tif". Verwenden Sie für CRM-Bilder die Zeichenfolge "CRM" anstelle von XXX (z. B. "CRMc01z05.tif"). HINWEIS: Entscheiden Sie, ob die 2D- oder 3D-Segmentierung für die Bilddaten am besten geeignet ist. Verwenden Sie eine 2D-Segmentierungsmethode in Situationen, in denen kleine Zellen auf eine 2D-Ebene beschränkt sind (z. B. Bakterienpopulation, die an einer Glasoberfläche haftet). Verwenden Sie die 3D-Segmentierungsmethode in Situationen, in denen die Zellpopulation in einem dreidimensionalen Raum verteilt ist (z. B. Biofilme und Gewebeproben) oder die Zellgrößen größer sind als die Dicke der optischen Scheibe (z. B. Hefezellen, Säugetierzellen). Informationen zur 2D-Segmentierung finden Sie in Abschnitt 4. Informationen zur 3D-Segmentierung finden Sie in Abschnitt 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 2D-Bildanalyse
<ol><li>Statten Sie einen Arbeitsplatz mit Bildanalysesoftware (z. B. MATLAB) aus.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellsegmentierung und Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch.<ol>
<li>Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.</li>
		<li>Doppelklicken sie und öffnen Sie eines der bereitgestellten Skripte "Script2D.m".</li>
		<li>Wechseln Sie zur Registerkarte Editor , und klicken Sie dann auf Ausführen. Ein Ordnerauswahlfenster sollte angezeigt werden.</li>
		<li>Wählen Sie das in Schritt 3.8 erstellte Verzeichnis aus und klicken Sie dann auf Öffnen , um fortzufahren. Ein Dialogfeld, in dem Sie zur Eingabe des Segmentierungsparameters aufgefordert werden, wird automatisch angezeigt. HINWEIS: Wählen Sie zu Testzwecken den bereitgestellten Datensatz aus ("Sample_2D"). Das Beispiel-Dataset wird als komprimierte Datei bereitgestellt und sollte im Voraus extrahiert werden.</li>
		<li>Geben Sie die Segmentierungsparameter ein: Schwellenwert der Bildbinarisierung (0−1) für die Bildbinarisierung = 0,45, Oberer Schwellenwert für einen Zellbereich (in Pixeln) = 200, Unterer Schwellenwert für einen Zellbereich (in Pixeln) = 10 und Anzahl der Detektoren = 32. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren. HINWEIS: Diese Parameter müssen je nach Bildqualität möglicherweise angepasst werden.</li>
		<li>Ein neues Bildfenster mit einem CRM-Bild sollte angezeigt werden. Wählen Sie einen beliebigen Hintergrundbereich (d. h. einen Bereich, in dem Zellen fehlen) aus, der für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden soll. Zeichnen Sie ein Rechteck innerhalb des CRM-Bildes durch Ziehen mit der Maus. Doppelklicken Sie innerhalb des ausgewählten Bereichs, um die Auswahl zu bestätigen.</li>
		<li>Suchen Sie ein neues Verzeichnis mit dem Namen Signatur in demselben Verzeichnis, das in Schritt 4.2.4 ausgewählt wurde. HINWEIS: Der bereitgestellte Code erstellt dieses Verzeichnis automatisch. Das Verzeichnis "Signatur" speichert die angeborene Fluoreszenzsignatur jeder mikrobiellen Zelle innerhalb einer Population als .png Dateien, die nach einem gemeinsamen Präfix "Signatur" fortlaufend nummeriert sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.3D Bildanalyse
<ol><li>Statten Sie einen Arbeitsplatz mit der Bildanalysesoftware (Table of Materials) aus.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellsegmentierung und Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch.<ol>
<li>Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.</li>
		<li>Doppelklicken Sie auf das bereitgestellte Skript "Script3D.m" und öffnen Sie es.</li>
		<li>Wechseln Sie zur Registerkarte Editor , und klicken Sie dann auf Ausführen. Ein Ordnerauswahlfenster sollte angezeigt werden.</li>
		<li>Wählen Sie das in Schritt 3.8 erstellte Verzeichnis aus und klicken Sie dann auf Öffnen , um fortzufahren. Ein Dialogfeld, das zur Eingabe der Segmentierungsparameter auffordert, wird automatisch angezeigt. HINWEIS: Wählen Sie zu Testzwecken den bereitgestellten Datensatz aus ("Sample_3D"). Das Beispiel-Dataset wird als komprimierte Datei bereitgestellt und sollte im Voraus extrahiert werden.</li>
		<li>Geben Sie die Segmentierungsparameter ein: Schwellenwert für die Bildbinarisation (0–1) für die Bildbinarisierung = 0,01, Oberer Schwellenwert für ein Zellenvolumen (in Pixeln) = 1.000, Unterer Schwellenwert für einen Zellbereich (in Pixeln) = 20, X-Pixelgröße [μm/Pixel] = 0,26, Y-Pixelgröße [μm/Pixel] = 0,26, Z-Pixelgröße [μm/Pixel] = 0,42 und Anzahl der Detektoren = 32. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren. Ein Dialogfeld, in dem Sie aufgefordert werden, die Anzahl der Anregungswellenlängen einzugeben, wird angezeigt. HINWEIS: Diese Parameter müssen je nach Bildqualität möglicherweise angepasst werden.</li>
		<li>Geben Sie die Anzahl der Wellenlängen ein, die für die Bildaufnahme verwendet werden (wenn z. B. 405, 488, 561, 630 verwendet werden, geben Sie 4 in das Dialogfeld ein). Klicken Sie auf OK.</li>
		<li>Geben Sie die Anregungswellenlängen in einer Reihenfolge von der kürzesten (d. h. Feldname: Anregung Nr. 1) bis zur längsten Wellenlänge in die Dialogfelder ein. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren. Ein neues Image-Fenster, das ein CRM-Image anzeigt, sollte angezeigt werden.</li>
		<li>Wählen Sie den beliebigen Hintergrundbereich (d. h. den Bereich, in dem Zellen fehlen) aus, der für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden soll. Zeichnen Sie ein Rechteck innerhalb des CRM-Bildes durch Ziehen mit der Maus. Doppelklicken Sie innerhalb des ausgewählten Bereichs, um die Auswahl zu bestätigen.</li>
		<li>Suchen Sie das Verzeichnis Signatur in dem in Schritt 5.2.4 ausgewählten Verzeichnis. HINWEIS: Der bereitgestellte Code erstellt dieses Verzeichnis automatisch. Das Verzeichnis "Signatur" speichert die angeborene Fluoreszenzsignatur jeder einzelnen mikrobiellen Zelle innerhalb einer Population als .png Dateien, die nach einem gemeinsamen Präfix "Signatur" fortlaufend nummeriert sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Statistische Auswertung
HINWEIS: Führen Sie dimensionale Reduktionstechniken (z. B. Hauptkomponentenanalyse [PCA]) durch, um die Verteilung der Hyperspektren der Zellpopulationen zu visualisieren. Das bereitgestellte Skript (PCA.py) führt PCA für zwei Zellpopulationen (d. h. zwei Klassen) aus.
<ol><li>Statten Sie einen Arbeitsplatz mit der Programmiersprache und den dazugehörigen Bibliotheken und Modulen aus (Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Erstellen Sie ein leeres Verzeichnis im Laufwerk C (oder einem gleichwertigen Laufwerk) und nennen Sie das Verzeichnis "Parent_directory" (d. h. C:/ Parent_ Verzeichnis).</li>
	<li>Speichern Sie die Fluoreszenzsignaturen (z. B. die in Schritt 4.2.7 generierten .png Dateien) jeder der beiden Zellpopulationen in zwei separaten Verzeichnissen. HINWEIS: Die beiden Verzeichnisse sollten sich beide im "Parent_directory" befinden. C:/Parent_directory/ <img alt="image 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">putidaKT2440/ <img alt="image 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Signatur01.png <img alt="image 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Signatur02.png <img alt="image 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">: <img alt="image 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">putidaKT2442/ 
	 <img alt="image 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Signatur01.png 
	 <img alt="image 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Signatur02.png 
	 <img alt="image 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">:</li>
	<li>Laden Sie PCA.py in die "Parent_directory" herunter.</li>
	<li>Öffnen Sie die Befehlszeilenschnittstelle der Arbeitsstation.</li>
	<li>Geben Sie "python C:/Parent_directory/PCA.py" in die Befehlszeilenschnittstelle ein.</li>
	<li>Wählen Sie "Parent_directory", nachdem die Meldung "Zielverzeichnis auswählen" angezeigt wird.</li>
	<li>Suchen Sie im "C:/Parent_directory" nach "PCA.png", das einen resultierenden PCA-Plot enthält.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metabolomics.">Microbial metabolomics.</a> Current Genomics. 12, 391-403 (2011).</li><li>Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+and+comparative+analysis+of+the+metabolically+versatile+Pseudomonas+putida+KT2440.">Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).</li><li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range,+high+copy+number,+RSF1010-derived+vectors,+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas.">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li><li>Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+analysis+of+DNA-binding+proteins+by+yeast+one-hybrid+and+one-two-hybrid+systems.">Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems.</a> Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).</li><li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+biofilm+development+in+a+microfluidic+device+using+modified+confocal+reflection+microscopy.">Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).</li><li>Lakowicz, J. 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C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+spectroscopy+and+imaging:+A+tool+for+biomedical+research+and+diagnosis.">Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Es gibt zwei kritische Punkte in dieser Methode, die genau verfolgt werden müssen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten: 1) Halten Sie die Laserleistung unter dem Mikroskopobjektiv durch Anregungswellenlängen und Experimente konsistent und 2) führen Sie eine genaue Zellsegmentierung durch.
Der erste Punkt ist besonders wichtig, wenn man die angeborene Fluoreszenzsignatur zwischen verschiedenen Experimenten vergleicht. Vermeiden Sie es, einfach die gleichen "prozentualen Ausgangseinstel...

Verschiedene Biomoleküle innerhalb einer Zelle1 emittieren Autofluoreszenzsignale, und die angeborene Fluoreszenzsignatur einer Zelle besteht aus der Anordnung dieser Signale. Diese charakteristische Fluoreszenz spiegelt verschiedene zelluläre Eigenschaften und auch Unterschiede im physiologischen Status wider. Die Analyse der angeborenen Fluoreszenz ist minimal-invasiv und kann traditionelle, invasivere mikrobiologische Sonden ergänzen, die eine Reihe von Spuren von leichter metabolischer Modifikation bis hin zur vollständigen Zellzerstörung hinterlassen. Während traditionelle Techniken wie die Extraktion von DNA- oder Zellinhalten2,3, die fluoreszierende In-situ-Hybridisierung4 und die Einführung fluoreszierender Reportergene in das Genom bei der Bestimmung des Zelltyps oder des physiologischen Status wirksam sind, erfordern sie in der Regel entweder eine Manipulation der Zellen oder eine invasive Markierung.
Studien zur angeborenen Fluoreszenz verschiedener lebender und intakter mikrobieller Kolonien, einschließlich mikrobieller Kultursuspensionen5,6, aktiver Schlämme7, Säugetiergewebe8,9 und Säugetierzellen1,10, haben gezeigt, dass die angeborene Fluoreszenzanalyse eine tagfreie Analyse von Zelltypen und physiologischem Status erleichtert. Angeborene Fluoreszenzsignaturen wurden traditionell auf Populationsebene und nicht auf Einzelzellebene analysiert und erfordern daher eine klonale Kultur. Im Gegensatz dazu rekonstruiert und katalogisiert die hier beschriebene confokale Reflection microscopy-assisted single cell innate fluorescence analysis (CRIF)-Technik11 die angeborene zelluläre Fluoreszenzsignatur jeder einzelnen lebenden mikrobiellen Zelle. Darüber hinaus kann CRIF systematisch die angeborene Fluoreszenzsignatur einer einzelnen mikrobiellen Zelle innerhalb einer Population sammeln, die in einem dreidimensionalen (3D) Raum verteilt ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="720">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agarose</td>
			<td style="width:220px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">312-01193</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Beam splitters</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cover slips</td>
			<td style="width:220px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C024601</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass slides</td>
			<td style="width:220px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S011120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Half-reflection mirror</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NT80/20</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Laser power meter</td>
			<td style="width:220px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">PM400 (power meter console) and S175C (sensor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LB Broth</td>
			<td style="width:220px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:119px;">20066-95</td>
			<td>For bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:220px;">The MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Microscope objective</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;">440762-9904</td>
			<td style="width:167px;">e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope software</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PBS(-)</td>
			<td style="width:220px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">166-23555</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:215px;">Programming language</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Silicone gasket</td>
			<td style="width:220px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P24744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Workstation</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1500-250G</td>
			<td>For yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">YPD medium</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstruction of single-cell innate fluorescence signatures by confocal microscopy

Beschrieben wird hier die konfokale Reflexionsmikroskopie-assistierte Einzelzell-Angeborenenfluoreszenzanalyse (CRIF), eine minimal-invasive Methode zur Rekonstruktion der angeborenen zellulären Fluoreszenzsignatur jeder einzelnen lebenden Zelle in einer Population, die in einem dreidimensionalen (3D) Raum verteilt ist. Die angeborene Fluoreszenzsignatur einer Zelle ist eine Sammlung von Fluoreszenzsignalen, die von verschiedenen Biomolekülen innerhalb der Zelle emittiert werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass angeborene Fluoreszenzsignaturen verschiedene zelluläre Eigenschaften und Unterschiede im physiologischen Status widerspiegeln und eine reichhaltige Informationsquelle für die Zellcharakterisierung und -identifizierung darstellen. Angeborene Fluoreszenzsignaturen wurden traditionell auf Populationsebene analysiert, was eine klonale Kultur erforderte, aber nicht auf Einzelzellebene. CRIF eignet sich besonders für Studien, die eine 3D-Auflösung und/oder selektive Extraktion von Fluoreszenzsignalen einzelner Zellen erfordern. Da die Fluoreszenzsignatur eine angeborene Eigenschaft einer Zelle ist, eignet sich CRIF auch zur tagfreien Vorhersage des Typs und/oder physiologischen Status intakter und einzelner Zellen. Diese Methode kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die optimierte Zellanalyse sein, bei der der Phänotyp jeder einzelnen Zelle in einer heterogenen Population direkt durch ihre Autofluoreszenzsignatur unter einem Mikroskop ohne Zellmarkierung beurteilt werden kann.

Abbildung 1A zeigt die typische einzellige Fluoreszenzsignatur einer Bakterienzelle, dargestellt als traditionelles Spektrumdiagramm (oben) und als Heatmap (Mitte). Abbildung 1B zeigt das Ergebnis einer genauen 2D-Zellsegmentierung, die dem ursprünglichen CRM-Bild einer Population von Bodenbakterien (Pseudomonas putida KT2440)12 überlagert wird. Die resultierenden angeborenen Fluoreszenzsignaturen für die Population sind in <s...

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Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Hier wird ein Protokoll zur optischen Extraktion und Katalogisierung angeborener zellulärer Fluoreszenzsignaturen (d.h. zelluläre Autofluoreszenz) aus jeder einzelnen lebenden Zelle vorgestellt, die in einem dreidimensionalen Raum verteilt ist. Diese Methode eignet sich, um die angeborene Fluoreszenzsignatur verschiedener biologischer Systeme mit einzelliger Auflösung zu untersuchen, einschließlich Zellen von Bakterien, Pilzen, Hefen, Pflanzen und Tieren.

Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch konfokale Mikroskopie

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

reconstruction-single-cell-innate-fluorescence-signatures-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

2.7K Aufrufe.  University of Tsukuba. Hier wird ein Protokoll zur optischen Extraktion und Katalogisierung angeborener zellulärer Fluoreszenzsignaturen (d.h. zelluläre Autofluoreszenz) aus jeder einzelnen lebenden Zelle vorgestellt, die in einem dreidimensionalen Raum verteilt ist. Diese Methode eignet sich, um die angeborene Fluoreszenzsignatur verschiedener biologischer Systeme mit einzelliger Auflösung zu untersuchen, einschließlich Zellen von Bakterien, Pilzen, Hefen, Pflanzen und Tieren.

Serie: Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in full sunshine. Most rhodophytes are red, however some can appear bluish, depending on the proportion of blue and red biliproteins (phycocyanin and phycoerythrin). Different phycobiliproteins can capture light at diverse wavelengths and transmit it to chlorophyll a, which makes photosynthesis under very different light conditions possible. These pigments respond to habitat changes in light, and their autofluorescence can help to study biological processes. Using Chroothece mobilis as a model organism and the spectral lambda scan mode in a confocal microscope, the adaptation of photosynthetic pigments to different monochromatic lights was studied at the cellular level to guess the species' optimal growth conditions. The results showed that, even when the studied strain was isolated from a cave, it adapted to both dim and medium light intensities. The presented method is especially useful for studying photosynthetic organisms that do not grow or grow very slowly under laboratory conditions, which is usually the case for those living in extreme habitats.

The present protocol describes step-by-step autofluorescence imaging and evaluation of phycobiliprotein changes in red algae based on spectral analysis. This is a label-free and non-destructive method to evaluate cellular adaptation to extreme habitats, when only scarce material is available and cells grow slowly, or not at all, under laboratory conditions.

Autofluoreszenz-Bildgebung zur Bewertung der Rotalgenphysiologie

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Bildgebung von mitochondrialem Peroxid in lebenden Hefezellen mit mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor im Rampenlicht: Advancing Mitochondrial Research - mtHyper7 Biosensor für die subzelluläre Analyse 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...