Diese Arbeit wurde von USDA Grants 1999-35212-8680, 2005-01378 und 2010-04288-01, USDA Formula Funds und dem Staat Veterinärmedizin Georgiens Agricultural Research Grant unterstützt. Das Protokoll in dieser Publikation beschrieben wurde für den Einsatz von Studenten im Rahmen der gezielten Forschung Kurse entwickelt: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L und BIOL 4960H an der University of Georgia und wird von den Schülern auf verschiedene molekulare Epidemiologie Forschungsprojekte in den Maurer Labor. Wir wollen die vielen Studenten, die Forschung geleistet haben, Maurer und Lee Labors und unserer Abteilung Stuhl, John Glisson für die Unterstützung unserer Bemühungen, Bachelor-Anweisung mit der Forschung zu integrieren danken.

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	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die meisten kommerziell verfügbaren PCR-Tests für den Nachweis von Salmonella Ziele Gene einzigartig für die Gattung (zB Invalidität). Allerdings sind nicht alle Salmonella gleich in ihrer Fähigkeit, Krankheiten an Menschen oder Prävalenz in Tierpopulationen verursachen. Frühzeitige Erkennung von antigenen Unterschiede in Salmonella LPS O-Antigen und flagellinH1 und H2-Antigene hat zur Differenzierung von Salmonella in mehr als 2.500 Serovare auf diesen antigene Unterschiede. Es gibt 46 verschiedene O-Antigene und 86 verschiedene Flagellin (H)-Antigene in der Gattung Salmonella identifiziert. Salmonella kann man (H1) oder zwei verschiedene (H1 &amp; H2) Flagellin besitzen. Die andere Kombination von O, H1, H2 und Antigenen für die 2.500 Salmonella-Serovare heute anerkannt. Ein Serovar wird auf Basis der antigenen Formel aus der Identifizierung der einzelnen O-und H-Antigene gewonnen zugeordnet. Die antigenen Formel ist wie O geschrieben: H1: H2, und wo &quot;-&quot;, bezieht sich auf das Fehlen von H1 oder H2 Flagellin und &quot;NT&quot; (nicht-typisierbaren) für Salmonellen negativ für die O-Antigen. Zum Beispiel ist der Serovar Typhimurium eine S. zugeordnet enterica Isolat mit der antigenen Formel B: i: 1,2, während Enteritidis eine mit der Formel D1 isolieren gegeben ist: g, m: -. Dieses Antigen-Variation in der Salmonella Bevölkerung ist die äußere Manifestation von Unterschieden bei der Nukleotid-Ebene, daher leicht durch PCR genutzt werden. Wir haben die genetischen Unterschiede mit spezifischen O-und H-Allele assoziiert zu einem allelotyping PCR zur ​​Identifizierung von S. zu entwickeln identifiziert enterica Serovare: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium (3). Die richtige Zuordnung und Berichterstattung von Salmonella Serovar erfordert die Prüfung für alle Allele, die mit O verbunden: H1: H2 antigenen Formeln für Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), und Typhimurium (B: i: 1,2). Ohne Kenntnis der O-Allels oder Antigen, die Feststellung des H1 g, hat m-Allels allein nicht unbedingt identifizieren Salmonella Enteritidis als andere Salmonella-Serovare isoliert: Agona, Kalifornien, und Montevideo, besitzen auch die gleiche Allel. Während die allelotyping PCR ursprünglich entworfen wurde, um zu erkennen in den Vordergrund genannten Salmonella-Serovare, kann dieser Test identifizieren zusätzliche 19 Serovare (Tabelle 3). Unsere allelotyping PCR wurde ursprünglich entwickelt, um O-und H-Allele zu erkennen. In der Praxis hat es sich mehr praktische und kostengünstige für uns die O-Antigen, das durch Objektträgeragglutination Test zu identifizieren, mit O-spezifischen Antiseren, anstatt die O allelotyping PCR bei der Arbeit mit isolierten Salmonella Kulturen. Aber wir empfehlen die Verwendung der O allelotyping PCR, wenn Ihr Labor verwendet diese PCR als Bildschirm (2) oder zur Eingabe von Salmonellen auf FTA-Karten (6) isoliert eingereicht, und verfügen über eine Salmonellen-spezifische PCR mit dem ersten Bildschirm von Proben (4 ). Begrenzen Sie die allelotyping PCRs, nur die Proben, die als Salmonella durch PCR oder biochemische / antigenen Tests identifiziert werden. Das Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird ist für den Einsatz mit dem Idaho Technology Rapidcycler, ein Heißluft-Thermocycler, dass man zu verkleinern Reaktionsvolumina und läuft Reaktionsbedingungen in weniger Zeit als viele Heizblock Thermocycler ermöglicht optimiert. Zur Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem Heizblock Thermocycler kann verlangen, Optimierung von Reaktionsbedingungen empirisch durch Absenken / Anheben Glühtemperaturen; Anpassung Primer-Konzentration oder Einstellung MgCl 2-Konzentrationen. Zum Beispiel mussten wir das Protokoll für die MJ Research PTC-200 Thermocycler wie folgt anzupassen. Arbeiten mit der gleichen Reaktion Bände in Tabelle 1 beschrieben, die Arbeiterklasse Lager concentrationof der i-Primer-Satzes auf 2,5 pM verdünnt war, wurde die Annealingtemperatur von 55 ° C bis 45 ° C und Inkubationszeiten bei der Denaturierung, Annealing und Extension Schritten gesenkt wurde auf 20 s für die i / g, m allelotyping PCR verlängert. Nach der entsprechenden positiven und negativen Kontrollen werden in der ersten Inbetriebnahme und Optimierung für jedes PCR, einschließlich veröffentlichten Protokollen von wesentlicher Bedeutung. Wir empfehlen den Erwerb bekannten Salmonella-Serovare, die speziell Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) und Typhimurium (B: i: 1,2) sowie ein Labor Escherichia coli K12-Stamm (DH5a, LE393, JM109, etc. ) als positive und negative Kontrollen jeweils für die allelotyping PCR-Tests in diesem Artikel beschrieben. Mehrere dieser Salmonella-Serovare als entweder positiv oder negativ Kontrollen dienen, je nachdem, welches Allel getestet. Bestimmte Vorsichtsmaßnahmen und Richtlinien müssen befolgt während der Durchführung dieser und anderen diagnostischen PCR werden. Erstens die räumliche Trennungder Vorlage Vorbereitung, Aufbau PCR und Gelelektrophorese ist von entscheidender Bedeutung bei der Verhinderung möglich PCR carry-over Kontamination und fehlerhafte Berichterstattung der Falsch-Positiven. Darüber hinaus ist die Einbeziehung der entsprechenden Kontrollen notwendig in jeder Routine PCR wie diese Kontrollen Probleme zu identifizieren, wie sie entstehen und helfen bei der Interpretation der Ergebnisse (5). Am wichtigsten ist, ist die Konsistenz wichtig, insbesondere im Hinblick auf die elektrophoretische Bedingungen für Amplikons (PCR-Produkt) Detektion andestimation von Amplicongröße. Um dies zu verdeutlichen, haben wir absichtlich ausgesetzt Elektrophorese früher als in 1A gedacht. Das Molekulargewicht-Standards (Spuren 1 und 13) und der positiven Kontrolle (Spur 2) sind nicht ausreichend getrennt, um genau zu schätzen Größen oder beobachten Trennung von DNA-Fragmenten, wo es kleine Unterschiede (~ 50 bp) in den Größen. Ausreichende Trennung von DNA-Fragmenten, insbesondere das Molekulargewicht-Standards ist notwendig, da die Berichterstattung Positive ist abhängig von der genauen Schätzung der Amplikon Größe und die Unterscheidung zwischen &quot;richtig positiv&quot; aus nicht-spezifischen Amplikons, die manchmal in den täglichen Ablauf einer PCR (5 eingehalten werden ). Zum Beispiel gibt es eine nicht-spezifische Amplikon in Abbildung 1B, Spur 7 (~ 700 bp groß). Hätte Elektrophorese zu früh, abgesetzt werden, wenn der Farbstoff vor nur auf dem halben Weg Punkt im Agarosegel, gäbe es wenig Unterschied zwischen 500 bp und 700 bp DNA-Fragmente werden. Daher würde Probe in Spur 7 irrtümlich gemeldet haben, als positiv für beide i und g, m-Allele. Schließlich muss man die Grenzen bei jedem Test assoziiert zu erkennen. Mehrere der H1/H2 allelotyping PCR nicht die Trennschärfe, um subtile genetische Unterschiede in Allele aus der H2 1,2 erkennen; 1,5; 1,6; 1,7 Antigen-Komplex; e, n, x / e , n, z15 Antigen-Komplex und dem H1 G-Antigen-Komplex, der die g, m-Allel enthält. Ein oder zwei Aminosäure-Veränderungen Rechnung für die unterschiedliche Epitope in diesen Flagellen-Antigene zu präsentieren. Es war daher schwierig für uns, Grundierungen, dass diese manchmal einzigen Basenpaar Unterschiede in der Flagellin Gensequenz (3) ausgenutzt werden könnte, um Design. Zum Beispiel Salmonella-Serovare Dublin (D1: g, p: -) - sind auch PCR-positiv mit unserem g, mallelotyping Grundierungen und Berta (D1:: f, g, t). Die H2 allelotyping Primer nicht unterscheiden kann, Typhimurium (B: i: 1,2) aus Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) aus Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), oder Remo (B: r: 1,7), oder Hadar (C2: z10: e, n, x) aus Glostrup (C2: z10: e, n, z15). Zwar ist die Wahrscheinlichkeit der Begegnung mit einigen dieser Serovare: Lagos, Bradford, Winneba, Remo oder Glustrup remote ist, ist es eine Möglichkeit und erfordert entweder die Bereitstellung Disclaimer auf der Prüfungen &quot;Beschränkung oder anderen Bestätigungstest. Im Ergebnis dieser PCR-basierten Serotypisierung schnell identifiziert S. enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg und Typhimurium und O, H1 und H2-Allele mit 19 zusätzlichen Serotypen assoziiert. Dieser Assay ist eine schnelle, kostengünstige Alternative zu herkömmlichen mikrobiologischen Ansatz zur Serotypisierung Salmonella.

<table border="1"><tbody><tr><th> Material Name </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentar </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> 1,5 ml Kapazität </td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> 200 Proof </td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Molecular Biology Grade </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle; PCR nur) </td></tr><tr><td> 10 x PCR-Puffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td> (Puffer wird mit BSA, Ficoll und Tartrazin) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR-Primer </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Kapillarpipetten </td><td> 10 pl Volumen </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schnelle Cycler </td><td></td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Low EBO; Molecular Biology Grade </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> 50 X TAE-Puffer oder 5X TBE Buffer </td><td></td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Ethidiumbromid </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Horizontal, Tauch-Gel-Elektrophorese Kammer mit Gelform </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Stromversorgung </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc-System </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Materialien

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Aktuelle kommerzielle PCRs Tests zur Identifizierung von Salmonella Zielgene einzigartig zu dieser Gattung. Allerdings gibt es zwei Arten, sechs Unterarten und über 2.500 verschiedene Salmonella Serovare, und nicht alle sind gleich in ihrer Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Zum Beispiel finden S. enterica Subspezies IIIa Arizona auf einem Tisch Ei-Schicht Betrieb ist unbedeutend im Vergleich zu der Isolierung von S. enterica Subspezies I Serovar Enteritidis, die führende Ursache von Salmonellose Zusammenhang mit dem Konsum von Konsumeiern. Serovare sind basierend auf antigene Unterschiede in Lipopolysaccharid (LPS) (O-Antigen) und Flagellin (H1 und H2-Antigene) identifiziert. Diese antigenen Unterschiede sind das äußere Erscheinungsbild der Vielfalt der Gene und Gen-Allele, die mit diesem Phänotyp assoziiert. Wir haben eine allelotyping entwickelt, Multiplex-PCR, die Tasten auf genetische Unterschiede zwischen vier großen S. enterica Subspezies I Serovare bei Geflügel gefunden und verbunden mit erheblichen menschlichen Erkrankungen in den USA. Die PCR-Primerpaare wurden die wichtigsten Gene oder Sequenzen nur an einem bestimmten Salmonella Serovar und entwickelt, um ein Amplikon mit einer Größe spezifisch für das Gen oder Allel produzieren ausgerichtet. Salmonella Serovar ist es, eine auf der Kombination von PCR-Test-Ergebnisse für spezifische LPS-Isolat zugeordnet und Flagellin-Gen-Allele. Die Multiplex-PCRs in diesem Artikel beschrieben werden für den Nachweis von S. spezifischen enterica Subspezies I Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Hier zeigen wir, wie die Multiplex-PCRs zu verwenden, um Serovar für eine Salmonellen identifizieren, isolieren.

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Wir beschreiben eine Multiplex-PCR zum schnellen Nachweis von Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Spezifische Salmonella-Serovare können, indem sie auf einer Multiplex-PCR, um Gene und Sequenzen einzigartig für die O-Antigen-Biosynthese-Cluster und Flagellin eines bestimmten Serovar identifiziert werden. Serovar wird dann auf eine Salmonellen zugeordnet isolieren über das Auftreten von bestimmten, Größe Amplikons (PCR-Produkt), entsprechend dem Ziel Allel auf.

Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

21.6K Aufrufe.  University of Georgia. Wir beschreiben eine Multiplex-PCR zum schnellen Nachweis von Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Spezifische Salmonella-Serovare können, indem sie auf einer Multiplex-PCR, um Gene und Sequenzen einzigartig für die O-Antigen-Biosynthese-Cluster und Flagellin eines bestimmten Serovar identifiziert werden. Serovar wird dann auf eine Salmonellen zugeordnet isolieren über das Auftreten von bestimmten, Größe Amplikons (PCR-Produkt...

Serie: An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. 
We generated model xenograft tumors in mice by subcutaneous injection of a human ovarian cancer cell line, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). 
We transformed attenuated strains of S. typhimurium bacteria (ELH430:SL1344 phoPQ- 1) with a constitutively expressed luciferase (luxCDABE) plasmid for visualization2. These strains specifically colonize tumors while remaining essentially non-virulent to the mouse1. 
Once measurable tumors were established, bacteria were injected intravenously via the tail vein with varying dosage. Tumor-localized, bacterial gene expression was monitored in real time over the course of 60 hours using an in vivo imaging system (IVIS). At each time point, tumors were excised, homogenized, and plated to quantitate bacterial colonies for correlation with gene expression data. 
Together, this data yields a quantitative measure of the in vivo growth and gene expression dynamics of bacteria growing inside tumors.

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. This video covers tumor cell preparation and implantation, bacteria preparation and injection, whole-animal luminescence imaging, tumor excision, and bacterial colony counting.

Mess-Wachstum und Genexpression von Tumor-Dynamics Targeted<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bakterien

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Verfahren zur Identifizierung von Infektions Prionen Nach Passage durch das Verdauungssystem von eine Vogelart

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Ein Protokoll zum Infect<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Mit<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Genotypisierung<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Durch ribosomalen Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...