Dieses modulare Protokoll ermöglicht es, mehrere molekulare Ereignisse zu untersuchen, die durch Struktur- und Signallipide und/oder RNAs in diskreten Geweberegionen und im Blut mit einer verbesserten quantitativen und qualitativen Datenausgabe pro Probenprobe dargestellt werden. Die Methode ist auf jedes experimentelle Modell anwendbar und kann auch auf menschliche Gewebeproben und Blut angewendet werden. Das Verfahren wird von Claudia Schwitter, einer Technikerin, Julia Post, einer Doktorandin, und Raissa Lerner, einer Postdoc in meiner Gruppe, demonstriert.
Nehmen Sie zunächst zuvor isolierte, ganze, gefrorene Gehirne von Mäusen mit akuter und prophylaktisch behandelter Kainsäure-induzierter Epilepsie. Montieren Sie die Gehirne auf das Montagesystem des Kryostaten. Stellen Sie die Dicke auf 50 Mikrometer ein und schneiden Sie das Gehirn im Trimmmodus in der Nähe der region von interesse.
Wenn Sie sich dem interessierenden Bereich nähern, stellen Sie die Dicke auf 18 bis 20 Mikrometer ein. Um die interessierende Subregion zu lokalisieren, färben Sie Gehirnschnitte mit Toluidinblau. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die gefärbten Scheiben zu inspizieren, um die zu stanzenden Regionen von Interesse zu identifizieren, und verwenden Sie einen Mausatlas als Referenz, um die geeigneten anatomischen Regionen des Gehirns zu finden.
Verwenden Sie Probenkorren, um Stempel mit einem Durchmesser von 0,8 bis 1,0 Millimetern aufzunehmen. Übertragen Sie die Stempel für Endocannabinoide und Eicosanoide-Koextrahierungen in vorgekühlte 2-Milliliter-Bernsteinrohre mit sieben vorgekühlten Stahlkugeln pro Rohr. Für die Koextrahierung von Phospholipiden und Endocannabinoide, duale Lipid- und RNA-Co-Extraktion werden die Stempel mit Keramikperlen in 2 Milliliter RNase-freie Extraktionsröhrchen überführt.
Wiegen Sie gefrorene Stempel im Kühlraum und fahren Sie sofort mit der Extraktion fort oder frieren Sie bei 80 Grad Celsius ein. Um eine Flüssig-Flüssig-Lipid-Koextraktion von Endocannabinoiden und Eicosanoiden aus Gehirnstücken, Stanzen oder Gewebepulverproben durchzuführen, legen Sie die Extraktionsröhrchen mit den Gewebeproben und sieben Stahlkugeln auf Eis. Fügen Sie 600 Mikroliter eiskaltes MTBE und 50 Mikroliter Acetonitrilwasser hinzu, das die internen Standards enthält.
Nach Zugabe von 400 Mikrolitern 0,1 molarer Ameisensäure verwenden Sie einen Gewebelyser, um für 30 Sekunden bis 1 Minute zu homogenisieren. Zentrifugieren Sie dieses Homogenat für 15 Minuten bei 5.000 mal g bei 4 Grad Celsius. Legen Sie es für 10 Minuten bei 80 Grad Celsius in den Gefrierschrank, um die wässrige untere Phase einzufrieren, was die Übertragung der oberen organischen Phase erleichtert.
Übertragen Sie die obere organische Phase in neue 1,5 Milliliter Bernsteinröhren, verdampfen Sie unter einem sanften Stickstoffstrom bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten und rekonstituieren Sie dann in 50 Mikrolitern Acetonitrilwasser zur weiteren Analyse. Lagern Sie die wässrige Phase bei 20 oder 80 Grad Celsius zur weiteren Analyse des Proteingehalts. Um Endocannabinoide und Eicosanoide aus Plasmaproben zu coexextrahieren, legen Sie die gefrorenen Plasmaproben auf Eis und lassen Sie sie vollständig auftauen.
Fügen Sie 800 Mikroliter MTBE und 50 Mikroliter Acetonitrilwasser hinzu, die die internen Standards enthalten, die für das Spiking mit Referenzplasmaproben optimiert sind. Fügen Sie 600 Mikroliter 0,1 molare Ameisensäure hinzu und wirbeln Sie bei 4 Grad Celsius für 2 Minuten. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 mal g für 15 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Übertragen Sie die organische Phase in neue Röhrchen. Verdampfen Sie es unter einem sanften Stickstoffstrom bei 37 Grad Celsius und rekonstituieren Sie es dann mit 50 Mikrolitern Acetonitrilwasser für die Flüssigkeitschromatographie-Multireaktionsüberwachungsanalyse. Um die Koextraktion von Phospholipiden und Endocannabinoiden aus Gehirnregionen, Stanzen oder anderen Gewebepulverproben durchzuführen, legen Sie die Extraktionsröhrchen mit den Gewebeproben und Keramikperlen auf Eis.
Fügen Sie 800 Mikroliter Methyl-tert-Butylether- und Methanolgemisch und 10 Mikroliter Methanol mit den internen Standards hinzu. Dann fügen Sie 200 Mikroliter 0,1% Ameisensäure mit 25 mikromolarem Tetrahydrolipstatin / URB597 und 50 Mikrogramm pro Milliliter BHT hinzu. Nach dem Homogenisieren mit einem Gewebehomogenisator zentrifugieren Sie bei 5.000 mal g und 4 Grad Celsius für 15 Minuten.
Die obere organische Phase in neue Röhrchen überführen, unter einem sanften Stickstoffstrom bei 37 Grad Celsius verdampfen und diesen Lipidextrakt dann mit 90 Mikrolitern Methanol rekonstituieren. Wenn Sie sofort fortfahren, fügen Sie 10% Wasser zu einem Aliquot Lipidextrakt hinzu und injizieren Sie 10 Mikroliter in die LC / MS zur Phospholipidanalyse. Für die weitere Endocannabinoid-Analyse fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
Nehmen Sie ein Aliquot des Lipidextrakts, verdampfen Sie es bis zur Trockenheit und rekonstituieren Sie es in Acetonitrilwasser. Durchführung der dualen Extraktion von RNA und Lipiden und Koextraktion von Phospholipiden und Endocannabinoiden aus Gewebeproben, auftauen von Gewebepulver-Aliquots oder Gehirnbündeln bei 4 Grad Celsius. Geben Sie das Gewebe mit Keramikperlen in Extraktionsröhrchen.
Dann fügen Sie 600 Mikroliter RLT-Puffer zusammen mit 200 Mikroliter Chloroform hinzu. Für die Phospholipid- und Endocannabinoid-Koextraktion werden die Proben mit 10 Mikrolitern interner Standardmischung gespießt und 20 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit homogenisiert. Homogenisierte Proben in neue Zentrifugenröhrchen überführen und fünf Minuten lang mit voller Geschwindigkeit und 4 Grad Celsius zentrifugieren, um die Phasentrennung zu ermöglichen.
Übertragen Sie die obere Phase in ein frisches Röhrchen zur RNA-Extraktion mit einem Standard-Kit. Elute extrahierte RNA in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern RNase-freiem Wasser und lagerte sie bei 80 Grad Celsius. Für die Lipidextraktion werden 800 Mikroliter MTBE/Methanol und 200 Mikroliter 0,1% Ameisensäure in die untere chloroformhaltige Phase gegeben.
Wirbel für 45 Minuten bei 4 Grad Celsius. Übertragen Sie die obere organische Phase in eine neue Röhre. Verdampfen Sie es unter einem sanften Stickstoffstrom bei 37 Grad Celsius.
Für weitere LC/MS-Analysen rekonstituieren Sie die Probe in 90 Mikroliter Methanol und lagern Sie sie bei 20 oder 80 Grad Celsius oder fahren Sie sofort mit der Analyse fort. Für die weitere Endocannabinoid-Analyse fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Nehmen Sie ein Aliquot des Lipidextrakts, verdampfen Sie es bis zur Trockenheit und rekonstituieren Sie es in Acetonitrilwasser.
Anschließend werden 20 Mikroliter in die LC/MS zur Endocannabinoid-Analyse injiziert. Kaininsäure-Induktion akuter epileptischer Anfälle führte eine Stunde nach der Injektion zu einer maximalen Anfallsintensität. Die lipidomische Profilierung von Endocannabinoiden und Eicosanoiden sowie Phospholipiden und Endocannabinoiden zeigt Lipidspiegeländerungen in der Großhirnrinde, im Striatum, in der thalamischen Region, im Hippocampus, im Hypothalamus, im Kleinhirn sowie im Herz- und Lungengewebe bei Kainsäure-induzierten epileptischen Mäusen und Kontrollen.
Nach der dualen Extraktion von Phospholipiden und Endocannabinoiden und RNA zur quantitativen Profilierung von Maus-Hirnschlägen wurde die quantitative Verteilung der Lipide im Hypothalamus, in der basolateralen Amygdala und im ventralen und dorsalen Hippocampus analysiert. Relative Expressionsniveaus von endogenen Enzymen und Rezeptoren, die an der Lipidsignalisierung beteiligt sind, sowie Marker für die Gehirnaktivität, die auf mRNA-Ebene in verschiedenen Gehirnregionen und Subregionen von Mäusen untersucht wurden, die kainsäureinduzierten epileptischen Anfällen und Kontrollen ausgesetzt waren. Kainsäure-induzierte Epilepsie verursachte einen massiven Verlust des NeuN-Signals, vorwiegend in der CA1-, CA3- und Hilus-Region des Hippocampus, begleitet von apoptotischen Ereignissen, die durch das Caspase-3-Signal im Vergleich zu den in Die Kontroll-Kochsalzlösung injizierten Mäusen angezeigt wurden.
Nach der Behandlung mit subchronischem Palmitoylethanolamid blieb das Proteinsignal der neuronalen Kerne merklich erhalten und das CASP3-Signal war kaum nachweisbar. Das Schlagen des Gehirns und das Sezieren diskreter Gehirnbereiche sind ziemlich herausfordernd und erfordern feine Fähigkeiten, um eine konsistente Probenahme über mehrere Kohorten hinweg zu erhalten. Daher werden das Üben an Testorganen und gute Kenntnisse der Gehirnmorphologie dringend empfohlen.
