Dieses Protokoll erleichtert die Herstellung und Verabreichung eines Virus- und Phagencocktails gegen Pseudomonas aeruginosa in Zebrafischembryonen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine in vivo Bewertung der Phagenwirksamkeit bei der Bekämpfung der bakteriellen Infektion ermöglicht. Der Phagencocktail ist sowohl bei Wildtyp- als auch bei Mukoviszidose-Zebrafischmodellen effizient.
Öffnung der Möglichkeit, die Phagentherapie auf bakterielle Infektionen bei Mukoviszidose-Patienten anzuwenden. Die Phage-Therapie kann auch angewendet werden, um bestimmten bakteriellen Infektionen in anderen Modellsystemen entgegenzuwirken. Vorbereitung eines Phagenbestands für das Experiment.
Fügen Sie 1,25 mal 10 zu den siebten Phagen zu einem OD 600 von 0.05 P.aeruginosa Kultur zu einer Vielzahl von Infektionen von ein mal 10 zu den negativen drei und bebrüten die Kultur für drei bis vier Stunden mit Schütteln, bis die OD 600 auf 0,1 bis 0,3 fällt. Am Ende der Inkubation inkubieren Sie das Lysat mit einem Mikrogramm pro Milliliter DNAse und RNAse für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Und pellet die Zellen durch Zentrifugation.
Am Ende des Zentrifugationsfilters den Überstand durch einen Porendurchmesser von 0,8 Mikrometer und 58 Gramm pro Liter Natriumchlorid und 105 Gramm pro Liter PEG 6000. Inkubieren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen, niederschlagen Sie den Phagen durch Zentrifugation.
Am Ende der Zentrifuge den Überstand entfernen und das Phagenpellet vorsichtig in 15 Milliliter Tris Natriumchloridpuffer auflösen. Um die Phagen durch Cäsiumchloriddichtegradienten zu reinigen, schichten Sie zunächst zwei Milliliter vier verschiedener Cäsiumchloridlösungen in Polyallomer-Ultrazentrifugenrohren für einen SW 41 Rotor und fügen 3,5 Milliliter der Phagensuspension zu jedem Rohr hinzu. Cäsiumchlorid ist giftig.
Nehmen Sie immer geeignete Sicherheitsverfahren bei der Handhabung und Entsorgung dieser Verbindung. Wenn alle Rohre geladen sind, legen Sie die Rohre in den Rotor, um darauf zu achten, dass die Rohre ausbalanciert sind. Und zentrifugieren Sie die Proben für zwei Stunden bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius.
Verwenden Sie am Ende der Zentrifugation eine Spritze mit einer 19-Meter-Nadel, um die weiße Schicht zwischen dem D und dem D gleich 1,4 Dichteregionen zu aspirieren. Und übertragen Sie die Aufhängungen in neue Polyallomerrohre der Größe SW 60. Zentrifugieren Sie die Suspensionen für mindestens 16 Stunden bei 150, 000 mal g und vier Grad Celsius.
Und übertragen Sie die sichtbaren Bänder in Dialyseröhren mit einem 6.000 Dalton Cutoff. Dann dialysieren Sie die gesammelten Proben zweimal gegen 500 Milliliter Wasser für 20 Minuten pro Dialyse und über Nacht gegen 500 Milliliter Tris Natriumchloridpuffer. Am nächsten Morgen den resultierenden Phagenbestand mit einem 0,22 Mikrometer Porenfilter filtern und bei vier Grad Celsius lagern.
Am Tag der Mikroinjektion zwei Mikromolarmorpholinos-Stammlösungen in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,25 Picomolar pro Embryo verdünnen, um eine 5-Mikroliter-Morpholino-Injektionslösung zu erhalten. Und fügen Sie 0,5 Mikroliter Phenolrot zu jeder Lösung hinzu. Als nächstes verwenden Sie eine 20 Mikroliter Mikropipette mit einer feinen Gel-Ladespitze, um eine Mikro-Injektionsnadel mit dem gesamten Volumen der Morpholino-Mischlösung zu laden und die Nadel an einem Mikromanipulator zu befestigen, der mit einem Ständer unter einem Stereomikroskop verbunden ist.
Dann mit ein oder zwei Zellen, Zebrafisch Embryonen auf einem Glasschlitten innerhalb einer 96 Millimeter Durchmesser Petrischale angeordnet, durchdringen die Chorion und das Eigelb mit der Mikro-Injektion Nadelspitze und injizieren zwei Nanoliter der Morphlino-Mischung in den Embryo. Nach der Befruchtung nach 26 Stunden eine Mikroinjektionsnadel mit etwa fünf Mikrolitern P.aeruginosa inoculum beladen und die Nadel dorsal an den Ausgangspunkt des Cuvierkanals legen, an dem sich der Kanal über den Eigelbsack auszubreiten beginnt. Injizieren Sie ein bis drei Nanoliter des PAO1-Inokulums in den Embryo, um sicherzustellen, dass sich das Volumen direkt innerhalb des Kanals ausdehnt und in den Kreislauf gelangt.
Nach der Injektion transferiert der Embryo in eine von zwei neuen Petrischalen mit frischem E3-Medium, ergänzt mit Phenylthiourea für eine 30-minütige oder dreistündige Inkubation bei 28 Grad Celsius. Als nächstes laden Sie eine Mikro-Injektionsnadel mit etwa fünf Mikrolitern des Phagencocktails und fixieren Sie die Nadel am Mikroinjektor. Dann injizieren Sie ein bis drei Nanoliter Phagencocktail in den Kanal von Cuvier jedes Embryos, der zuvor mit Bakterien injiziert wurde, und legen Sie die Embryonen in eine von zwei neuen Petrischalen, die frisches E3-Medium enthalten, das mit Phenylthiourea bei 28 Grad Celsius ergänzt wird.
Nach einer vierstündigen Nachinfektion verwenden Sie eine Plastikpipette, um einen anästhesierten Embryo in eine Glasbodenschale zu übertragen. Und füllen Sie die Schale mit warmen niedrigen Schmelzpunkt Agarose Lösung. Wenn die Agarose kalt ist, füllen Sie die Schale vorsichtig mit E3 Medium, ergänzt mit Anästhetikumlösung.
Legen Sie die Schale unter das Stereomikroskop und positionieren Sie den Embryo mit einer Pipettenspitze in der gewünschten Ausrichtung. Dann legen Sie die Schale unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop mit einem Fluoreszenzfilter für GFP-positive Bakterien für bis zu 18 Stunden nach der Infektion und stellen Sie den Embryo für das Fortschreiten der GFP-Expression bei neun, 14 und 18 Stunden nach der Infektion ab. Um die bakterielle Belastung nach acht Stunden nach der Infektion zu bestimmen, übertragen Sie 15 anästhesierte mikroinjizierte Embryonen in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und ersetzen die Anästhesielösung durch 300 Mikroliter 1%Triton X-100 in PBS.
Passieren Sie die Nadeln mindestens 15 Mal durch die sterile 27-Meter-Nadel einer Insulinspritze, um die Embryonen zu homogenisieren. Und vorbereiten serielle Verdünnungen des Homogenats durch Übertragung von 100 Mikroliter n der resultierenden Mischung in 900 Mikroliter steriler PBS pro Verdünnung. Zur Auswahl des natürlich ampicillinresistenten P.aeruginosa-Stamms 10 Mikroliter der Verdünnungen auf LB-Agar mit Ampicillin ergänzt und über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrütet.
Am nächsten Tag zählen die Anzahl der Kolonien. Um die Berechnung der Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten und der durchschnittlichen Anzahl von Koloniebildenden Einheiten pro infiziertem Embryo zu ermöglichen. Um die Letalität der P.aeruginosa-Infektion zu bewerten, bewerten Sie die injizierten Embryonen nach der Infektion 20 Stunden nach der Infektion unter einem Stereomikroskop, indem sie die Anzahl der toten weißen undurchsichtigen Embryonen zählen.
Berechnen Sie dann die halbmaximale tödliche Konzentration 50 Dosis von P.aeruginosa, die zum Tod von 50% der injizierten Embryonen nach 20 Stunden nach der Infektion führte. Zur Validierung des Mukoviszidose-Phänotyps kann die gestörte Position der inneren Organe wie Herzleber und Bauchspeicheldrüse bewertet werden. Die bakterielle Belastung wird durch Phagentherapie bei mukovisen Fibrose-Embryonen, die mit P.Aeruginosa infiziert sind, reduziert.
In 48 Stunden nach der Befruchtung mukovisen Fibrose Embryonen mit GFP-positiven P.Aeroginosa-Bakterien infiziert eine 30 Kolonie bildende Einheiten pro Embryo Dosis zeigt eine 50%tödliche Nachinfektion. Phage-Therapie ist gleichermaßen wirksam bei 20 Stunden nach der Infektion, wenn 30 Minuten oder sieben Stunden nach der bakteriellen Injektion geliefert. Hier wird eine Mukoviszidose und GFP-positive P.Aeruginosa injizierte Embryo bei vier, neun, 14 und 18 Stunden nach der Infektion gezeigt.
Im Gegensatz dazu zeigt die Mukoviszidose plus P.Aeruginosa plus Phagen injiziert embryonal eine reduzierte Fluoreszenz durch die Phagenwirkung gegen die Bakterien. Die entzündliche Reaktion, die durch eine P.aeruginosa-Infektion bei Mukoviszidose-Embryonen erzeugt wird, ist signifikant erhöht, wie die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine, TNF alpha und Interleukin 1 beta nach DerP.aeruginosa-Injektion zeigt, verglichen mit der Kontrolle injizierter Zebrafische. Die Expression der beiden entzündlichen Zytokine wird jedoch bei Phagencocktail-Mitinjizierten reduziert.
Die Phagen müssen sorgfältig gereinigt werden, um kontaminierendes Endotoxin zu entfernen, das während der Zubereitung zurückgehalten werden kann. Die Phagenpräparate können mittels Elektronenmikroskopie analysiert werden, um die Virionmorphologie zu bewerten. Es wäre interessant zu testen, ob die Infektion bei menschlichen Patienten durch andere Bakterien als Pseudomonas aeruginosa mit Phagentherapie im Zebrafischmodell der Mukoviszidose geheilt werden kann.
