Name: imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos at JoVE.com

Die Autoren würdigen die Arbeit von Liuliu Zheng und Zenghui Xue, die diese Technik im Sokac-Labor mitvorangetrieben haben, sowie Hasan Seede, der bei der Analyse mitgeholfen hat. Die Arbeit für diese Studie wird durch ein Stipendium des NIH (R01 GM115111) finanziert.

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	<li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos.">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li><li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/cofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion.">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li><li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies.">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li><li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF/cofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function.">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li><li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases.">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li><li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease.">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li><li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+actin-ADF/cofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons.">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li><li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress.">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li><li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells.">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li><li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin.">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li><li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein,+cofilin.">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li><li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods.">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li><li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+development,+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons.">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li><li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus.">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li><li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells.">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li><li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells.">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li><li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage.">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li><li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuf,+a+Rab11+effector,+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization.">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li><li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation.">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li><li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos.">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).</li><li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos.">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).</li><li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila.">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo.">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).</li><li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers.">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).</li><li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology.">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li><li>Mollinari, C., Gonz&#225;lez, A., Cid-Arregui, A., Garc&#237;a-Carranc&#225;, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+and+transgenesis.">Microinjection and transgenesis.</a> Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos.">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).</li><li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li><li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster.">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li><li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing.">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte deklariert.

Die Bedeutung dieser Methode ist, dass sie das etablierte Protokoll der Mikroinjektion in Drosophila-Embryonen 21,22,23,24,25,26,27 nutzt, um neue Forschungen in Bezug auf die ASR und die begleitende Aktinstabmontage zu ermöglichen. Ein großer Vorteil der Injektion von G-ActinRed in lebende Embryonen ist, dass die ASR in einer Vielzahl von Kontexten untersucht werden kann. Für zukünftige Studien können diese Kontexte die Injektion von Embryonen anderer Genotypen als Teil eines mutierten Bildschirms oder die Exposition injizierter Embryonen verschiedenen Stressbedingungen, wie oxidativem Stress4,32, umfassen. Obwohl hier nicht im Detail beschrieben, kann diese Injektionstechnik auch modifiziert werden, um Nukleinsäuren, andere Proteine, Medikamente und Indikatorfarbstoffe zu injizieren (Beispiele siehe21,22,23,24,32), um die ASR zu untersuchen. Daher bietet diese Methode eine Reihe von Ansätzen zur Identifizierung des Bezugsbereichs von Spannungen, die ASR induzieren, weitere Charakterisierung zellulärer Reaktionen während der ASR (z. B. Veränderungen der mitochondrialen Aktivität) und aufdecken neue Moleküle und Mechanismen, die der intranuklearen Aktinstab-Montage zugrunde liegen.
Einige wichtige Schritte des Protokolls umfassen die folgenden: In Schritt 3.8 müssen Embryonen ordnungsgemäß ausgetrocknet werden, um eine erfolgreiche Injektion und eine optimale Embryogesundheit zu gewährleisten. Die Trocknungszeit hängt von der Umgebungstemperatur und Der Luftfeuchtigkeit des Labors ab, daher wird empfohlen, zuerst die Montage, Austrocknung und Injektionen mit einem neutralen pH-Puffer zu üben, um diesen Parameter für den Umgang mit den Embryonen festzulegen. In Schritt 4.5 müssen die Mikronadel- und Injektionseinstellungen fein abgestimmt sein, um die Injektion von genügendG-Actin-Rot in Embryonen zu ermöglichen. Wenn zu wenig G-ActinRed in den Embryo injiziert wird, können Aktinstäbe nicht leicht zu visualisieren sein, da die Bildung von Aktinstäben von der Konzentration von freiem Aktin1abhängt. Darüber hinaus wird es schwierig sein, konsistente Ergebnisse aus FRAP-Experimenten zu erhalten, wenn nicht genug G-ActinRed injiziert wird, da die Fluoreszenzintensität nicht hoch genug sein wird, um die Hintergrundfluoreszenz zu überwinden. Daher ist es wichtig, die Blasengröße jedes Mal zu kalibrieren, wenn eine neue Nadel geladen und verwendet wird. G-ActinRed ist zähflüssig und neigt dazu, innerhalb der Mikronadel zu verstopfen. Manchmal kann dies dazu führen, dass den Embryonen variable Mengen an G-Actin injiziert werden. Wenn die Mikronadel verstopft ist und die Reinigung der Mikronadel mit hohem Druck fehlschlägt, kann es notwendig sein, zu versuchen, die Spitze der Mikronadel weiter zu brechen oder sogar eine neue Mikronadel zu laden und einen frischen Satz von Embryonen zu injizieren. Schließlich müssen in Schritt 4.11 Embryonen bei erhöhter Temperatur und so lange inkubiert werden, dass die ASR induziert und Die Stäbe1bilden können. Die Temperaturen aller Brutkästen sollten ständig überwacht werden, die Zeit für den Transfer von Embryonen vom Inkubator zum Inkubator muss begrenzt sein, und für alle Inkubationen sollte ein Timer verwendet werden. Weitere mögliche Probleme sind in Tabelle 2 mit den begleitenden Tipps zur Fehlerbehebung aufgeführt.
Eine wesentliche Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass außerordentlich eisern darauf geachtet werden muss, die Gesundheit der Embryonen während Injektionen, Inkubationen und Bildgebung zu erhalten. Das Protokoll wurde entwickelt, um die Gesundheit von Embryonen zu maximieren, und mit signifikanter Praxis kann ein Forscher alle Schritte des Protokolls mit embryonalen Fortschritten bei den erwarteten Raten pro Temperatur31abschließen. Eine zweite Einschränkung des Protokolls ist die Notwendigkeit eines Mikroinjektionsgeräts, das ziemlich teuer sein kann und nicht für jedes Fliegenlabor üblich ist. Wenn jedoch ein benachbartes Labor für die Injektion anderer Embryonen (z. B. Xenopus, Zebrafisch und Caenorhabditis elegans)oder anhaftenden Zellen ausgestattet ist, ist das verwendete Injektionsrig wahrscheinlich für Drosophila-Injektionen geeignet. In diesem Fall muss nur die Form der Nadel für Drosophila-Embryonen nach den Richtlinien des Pipette Cookbook29angepasst werden. Alternativ gibt es einige kostengünstigere Micoinjector-Optionen auf dem Markt (z. B. analoge Mikroinjektoren), die die Kosten für die Montage eines Injektionsgeräts deutlich senken können.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Man G-ActinRed injizieren, um die Montage von intranuklearen Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu visualisieren, die sich einer induzierbaren Actin-Stressreaktion (ASR)1unterziehen. Wir entwickelten dieses Protokoll, um Studien der ASR zu unterstützen, die bei Embryonen zu gestörter Morphogenese und verminderter Lebensfähigkeit führt, und bei erwachsenen menschlichen Zelltypen ist mit Pathologien wie Nierenversagen2, Muskelmyopathien3und Alzheimer und Huntington4,5,6,7,8verbunden. Dieser ASR wird durch zahlreiche zelluläre Spannungen induziert, einschließlich Hitzeschock9,10,11, oxidativer Stress4,6, reduzierte ATP-Synthese12, und abnormale Huntingtin oder β-Amyloid-Oligomerisierung4,5,6,7,9,13,14,15,16. Ein Markenzeichen der ASR ist die Montage von abnormen Aktinstäben im Zytoplasma oder Kern der betroffenen Zellen, die durch stressinduzierte Hyperaktivierung eines Aktin-interagierenden Proteins, Cofilin1,5,6,10angetrieben wird. Leider bestehen nach wie vor wesentliche Wissenslücken in Bezug auf die ASR. Beispielsweise ist die Funktion der Aktinstäbe nicht bekannt. Wir verstehen nicht, warum Sichstäbe im Zytoplasma einiger Zelltypen bilden, aber der Kern anderer. Es ist auch nicht klar, ob die ASR für Zellen oder Embryonen, die sich stressfähig befinden, schützend oder maladaptiv ist. Schließlich kennen wir immer noch nicht die detaillierten Mechanismen, die der Cofilin-Hyperaktivierung oder Aktinstab-Montage zugrunde liegen. Somit bietet dieses Protokoll einen schnellen und vielseitigen Test zur Untersuchung des ASR, indem es die Aktinstabbildung und -dynamik im hochgradig beziehbaren Versuchssystem des lebenden Fruchtfliegenembryons visualisiert.
Das Protokoll zur Mikroinjektion von G-ActinRed in lebende Drosophila-Embryonen wurde ursprünglich entwickelt, um die Dynamik normaler zytoplasmatischer Aktinstrukturen17 während gewebebildender Ereignisse zu untersuchen. In diesen Studien fanden wir heraus, dass die G-Actin-Rot-Injektion die frühen Entwicklungsprozesse im Embryo, einschließlich Zytokinese oder Gastrulation17, 18, nicht beeinträchtigte. Wir modifizierten dann das Protokoll, passten die Embryo-Handhabung und G-ActinRed Injektion an, um die Bildgebung von Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu ermöglichen, die sich dem ASR1unterziehen. Andere Methoden neben G-ActinRote Injektion kann verwendet werden, um Actin in Embryonen zu visualisieren. Diese Methoden basieren auf der Exdinsiz fluoreszierender Proteine (FPs), die mit Actin oder Domänen von Actin-bindenden Proteinen wie Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP und Moesin-GFP (rezensiert in19) markiert sind. Die Verwendung dieser FP-Sonden erfordert jedoch Vorsicht, da sie einige Aktinstrukturen stabilisieren oder stören können, nicht alle Aktinstrukturen20gleich kennzeichnen und im Falle von Actin-GFP stark überexprimiert werden – problematisch für die Analyse der Stabmontage, die nicht nur stressabhängig, sondern auch aktinkonzentrationsabhängigist 1. Somit ist G-ActinRed die bevorzugte Sonde für Stabstudien an Fliegenembryonen, und die große Größe des Embryos ermöglicht seine einfache Injektion.
Der Arbeitsablauf dieses Protokolls ähnelt anderen etablierten Mikroinjektionstechniken, die zur Injektion von Proteinen, Nukleinsäuren, Medikamenten und fluoreszierenden Indikatoren in Drosophila-Embryonen 21,22,23,24,25,26,27verwendet wurden. Nach der Mikroinjektion von G-ActinRed sind Embryonen jedoch leichtem Hitzestress ausgesetzt, um die ASR- und intranukleare Aktinstab-Montage zu induzieren. Für Labore mit Zugang zu Fliegen und einem Injektionssystem sollte diese Methode für bestimmte Studienlinien in Bezug auf die ASR leicht umsetzbar und anpassungsfähig sein, einschließlich ihrer Induktion durch unterschiedliche Spannungen oder Modulation in unterschiedlichen genetischen Hintergründen.

<table><tbody><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Apple juice, Mott&#039;s, 64 fl oz</td><td>Mott&#039;s</td><td>014800000344</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;mu;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>For collecting dechorionated embryos</td></tr><tr><td>Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>For imaging intranuclear actin rods</td></tr><tr><td>Desiccant</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>For desiccating embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Dissecting needle, 5 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>For making embryo glue</td></tr><tr><td>Embryo collection cage</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>For housing adult flies and collecting embryos</td></tr><tr><td>Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701D</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>For microneedles</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>For hydration of embryos</td></tr><tr><td>Heated stage incubator</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>For confocal imaging</td></tr><tr><td>Lab Tissue Wipers, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Lab tissue wipers</td></tr><tr><td>Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>Injection microscope</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Microinjector, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>For loading microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Custom</td><td>For performing microinjections</td></tr><tr><td>Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>For pulling capillary tubes to make microneedles</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 24x50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>For mounting embryos</td></tr><tr><td>Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>For mounting embryos for injection</td></tr><tr><td>n-Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Component of embryo glue</td></tr><tr><td>Objective, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>10x objective for injection microscope</td></tr><tr><td>Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>40x water objective for confocal</td></tr><tr><td>Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x mixed immersion objective for confocal</td></tr><tr><td>Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x oil objective for confocal</td></tr><tr><td>Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>For transferring embryos</td></tr><tr><td>Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>For blotting cell strainer</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 5 3/4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>For covering embryos with oil</td></tr><tr><td>Petri dish, glass, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>For humid incubation chamber</td></tr><tr><td>Petri dish, plastic, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>For apple juice plates</td></tr><tr><td>Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>For loading the microneedle</td></tr><tr><td>Pipette tip, xTIP4 250 &amp;mu;L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>For adding embryo glue to coverslip</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>For cutting agar wedge, tape, pipette tips</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 &amp;mu;g)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>For making embryo glue</td></tr><tr><td>Screw top jar, 16 oz</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>For desiccating embryos</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>602104PG</td><td>For calibrating volume of G-actin injection</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Component of yeast paste</td></tr></tbody></table>

imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos

Der Zweck dieses Protokolls ist es, intranukleare Aktinstäbe zu visualisieren, die sich in lebenden Drosophila melanogaster Embryonen nach Hitzestress zusammensetzen. Actin-Stäbe sind ein Kennzeichen einer konservierten, induktiven Actin Stress Response (ASR), die menschliche Pathologien begleitet, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die ASR zu Morphogenese-Ausfällen und einer verminderten Lebensfähigkeit der sich entwickelnden Embryonen beiträgt. Dieses Protokoll ermöglicht die kontinuierliche Untersuchung der Mechanismen, die der Aktinstabbaugruppe und der ASR in einem Modellsystem zugrunde liegen, das sehr bildgebend, genetisch und biochemie geeignet ist. Embryonen werden gesammelt und auf einem Deckslip montiert, um sie für die Injektion vorzubereiten. Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin (G-ActinRed) wird verdünnt und in eine Mikronadel geladen. Eine einzige Injektion erfolgt in das Zentrum jedes Embryos. Nach der Injektion werden Embryonen bei erhöhter Temperatur inkubiert und intranukleare Aktinstäbe werden dann durch konfokale Mikroskopie visualisiert. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) Experimente können an den Aktinstäben durchgeführt werden; und andere aktinreiche Strukturen im Zytoplasma können ebenfalls abgebildet werden. Wir stellen fest, dass G-ActinRed wie endogenes G-Actin polymerisiert und allein nicht die normale Embryoentwicklung beeinträchtigt. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass während der Injektion Vorsicht geboten ist, um eine schwere Verletzung des Embryos zu vermeiden. Jedoch, mit der Praxis, Injektion von G-ActinRot in Drosophila Embryonen ist eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, Aktin-Stäbe zu visualisieren und kann leicht mit Fliegen jeder Art oder mit der Einführung von anderen zellulären Spannungen verwendet werden, einschließlich Hypoxie und oxidativen Stress.

In Abbildung 1ist ein schematischer Arbeitsablauf für die Handhabung von Embryonen dargestellt, und in Tabelle 1ist ein Zeitplan für ein typisches Experiment dargestellt. Eine Schätzung für ein gutes experimentelles Ergebnis ist, dass auf 10 injizierte Embryonen mindestens die Hälfte der betrachteten Embryonen im richtigen Entwicklungsstadium sein wird, unbeschädigt, und eine robuste ASR mit Hitzespannung bei 32 °C aufweisen. Diese ASR wird durch die Montage von intranuklearen Aktinstäben nachgewiesen, wie im repräsentativen Oberflächenansichtsbild eines Embryos in Abbildung 2A (rechtes Panel) dargestellt. Aktinstäbe erscheinen in mehreren Ausrichtungen (parallel oder senkrecht zur Bildebene) innerhalb der Kerne und können durch mehrere Brennebenen abgebildet werden. Im Vergleich dazu zeigen Kontrollembryonen, die bei 18 °C inkubiert werden, keine Aktinstäbe an(Abbildung 2A, linkes Panel). Die prozentualen Kerne, die Stäbe enthalten, können quantifiziert werden, wie abbildung 2Bgezeigt. Darüber hinaus können FRAP-Experimente an Stäben durchgeführt werden (Abbildung 2C). Eine vorgeschlagene Quantifizierungsmethode für FRAP-Daten wird in1 referenziert und ein Beispiel für ein Fluoreszenzrückgewinnungsdiagramm für einen gebleichten oder ungebleichten Bereich eines Aktinstabs ist in Abbildung 2Ddargestellt.
Wenn ein Embryo durch Injektion stark geschädigt wird oder während des Experiments zu trocken wird, kann eine mitotische Asynchronie beobachtet und die Zellulisierung gestört werden. Manchmal sind Stäbe möglicherweise nicht sichtbar, weil sie nicht genug Aktin in den Embryo injiziert bekommen. In diesem Fall stellen Sie sicher, dass die Menge an G-ActinRed injiziert 500 pL (gemessen mit einem Mikrometer in Schritt 4.5) und bestätigen, dass diese Menge zwischen Embryonen konsistent bleibt, indem Sie eine Testinjektion in das umgebende Öl, um die Größe der G-ActinRed Blase zwischen jedem Embryo Mikroinjektion zu überprüfen. Um die Stabvisualisierung zu gewährleisten, arbeiten Sie schnell daran, den Deckelzuschlag hinzuzufügen und die Embryonen in die beheizte Mikroskopstufe zu versetzen, sobald sie in Schritt 5.4 aus der feuchten Kammer entnommen werden, da die Stabanordnung reversibelist 1 und Die Stäbe zerlegen können, wenn die Embryonen mehr als 30 min bei einer Temperatur von weniger als 32°C gehalten werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61297/61297fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Handhabung von Embryonen während des Experiments. (1) Erwachsene Fliegen in Embryo-Sammlung Tassen legen Embryonen auf Apfelsaft Agar Teller. (2) Embryonen werden mit 1:1 Bleichmittel dechorioniert: destilliertes Wasser, in einen Sammelkorb gegossen und gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, um Bleichmittel und Schmutz zu entfernen. (3) Embryonen werden mit einem Pinsel auf einen rechteckigen Apfelsaft-Agarkeil auf der Rutsche übertragen und an ihren Seiten, von Kopf zu Schwanz, mit rückenförmigem Bereich am Rand des Agars angeordnet. (4) Ein 5 x 50 mm Bereich eines Glasdeckels (orange) wird mit "Embryokleber" beschichtet und sanft auf die auf dem Agar angeordnete Embryonenreihe gedrückt, um sie am Deckschein zu befestigen. (5) Der Deckschein mit Embryonen wird invertiert, so dass Embryonen nach oben treten. Die Embryonen werden in einem Schraub-Top-Glas ausgetrocknet. (6) Unmittelbar nach der Austrocknung wird der Deckslip auf einen Schlitten geklebt, Embryonen nach oben und Embryonen mit Halocarbon 27-Öl bedeckt. (7) Eine Mikronadel, die zuvor mit präpariertem G-ActinRed beladen war, wird verwendet, um eine einzige Injektion in die Mitte des ventralen Bereichs jedes Embryos zu machen, wobei die Nadel parallel zum Abdeckrutsch positioniert ist. (8) Nach der Injektion werden Embryonen in einer Petrischale mit feuchten Laborgewebewischern bei der Regeltemperatur (18 °C) oder mit Hitzespannung (32 °C) befeuchtet. (9) Nach der Inkubation wird der Deckelrutsch mit den Embryonen auf ihm aus der Folie entfernt. (10) Zwei Stücke doppelseitiges Klebeband werden übereinander geschichtet, in der Länge halbiert und auf beiden Seiten des Öls um die Embryonen auf dem ersten Deckslip platziert. Ein zweiter Deckslip (blau) wird auf der ersten platziert, um eine neue bildgebende Oberfläche zu erstellen, die versetzt wird, so dass es eine Lücke für mehr Öl hinterlässt, um die Embryonen bei Bedarf zu bedecken. (11) Bei der Bildgebung auf einem invertierten konfokalen Mikroskop wird das Coverslip-Sandwich invertiert, so dass der zweite Deckelschlupf dem Ziel entspricht. Die Bildgebung erfolgt in einer inkubierten Kammer, und Aktinstäbe werden über mehrere Brennebenen der Kerne jedes Embryos visualisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61297/61297fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61297/61297fig2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse von Aktinstäben in wärmegestressten Embryonen. (A) Actin-Stäbe sind nicht in einem Embryo zu sehen, der bei einer Kontrolltemperatur von 18 °C inkubiert wurde (linkes Panel), sondern in den Kernen eines Embryos, der bei 32 °C wärmebelastet war (rechtes Panel). (B) Quantifizierung des Anteils der Kerne mit Aktinstäben aus einem repräsentativen Experiment. Jeder Punkt stellt einen Embryo dar, bei dem Stäbe und Kerne im gesamten bildnerischen Bereich gezählt wurden (n = 22 Embryonen bei 18 °C; n = 23 Embryonen bei 32 °C; Fehlerbalken zeigen Standardabweichung). Ein Student t-Test, bei dem eine ungleiche Varianz angenommen wurde, wurde verwendet, um den p-Wert zu berechnen. (C) Eine repräsentative Zeitreihe zeigt FRAP auf einer Aktinstange. Der Teil der Stange, der gebleicht wurde, wird durch eine weiße Pfeilspitze angezeigt. Vorbleichen ist 2 s vor dem Bleichschritt. Zeit = 0 s ist der Bleichschritt, und fluoreszenzerholung wurde bis 60 s post bleich nach der Bleichmittel nachverfolgt. (D) Ein Diagramm zeigt die Rückgewinnungsdynamik für die Aktinfluoreszenz in einem gebleichten Bereich eines Stabes im Vergleich zu einem ungebleichten Bereich in demselben Stab. Stäbe sind bemerkenswert stabil und Actin in ihnen nicht Umsatz. Somit ist keine Erholung zu sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61297/61297fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Experimenteller Arbeitsablauf mit vorgeschlagenem Zeitplan. Dieser Zeitplan fasst die erwartete Zeit zusammen, die zum Abschließen der einzelnen Schritte des Protokolls verwendet wird.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Bestellung</td>
			<td>Schritt</td>
			<td>Erforderliche Zeit für jeden Schritt</td>
			<td>Beschreibung</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>5 Tage im Voraus</td>
			<td>Machen Sie Embryo-Sammlung Sa0erkäfige. Apfelsaft Agar Teller gießen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.2-1.3</td>
			<td>2 Tage im Voraus</td>
			<td>Richten Sie Sammelkäfige mit erwachsenen männlichen und weiblichen Fliegen ein.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>2.6 Hinweis</td>
			<td>1 Tag im Voraus</td>
			<td>Ziehen Sie Kapillarrohre, um Mikronadeln herzustellen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>2.1-2.6</td>
			<td>1 h</td>
			<td>Bereiten Sie G-Actin vor.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>3.1</td>
			<td>30 Min.</td>
			<td>Lassen Sie Fliegen Eier legen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>3.2-3.10</td>
			<td>15-30 Min.</td>
			<td>Sammeln, montieren, entimitieren Embryonen. Embryonen mit Öl bedecken.</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4.1</td>
			<td>30 min im Voraus</td>
			<td>Bereiten Sie feuchte Inkubationskammern vor.</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>4.2-4.4</td>
			<td>1 Min.</td>
			<td>Laden Sie Mikronadel.</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>4.5-4.10</td>
			<td>10-20 min</td>
			<td>Kalibrieren Sie die Größe der G-Actin-Blasen und injizieren Sie Embryonen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>4.11</td>
			<td>30 min-1+ h</td>
			<td>Inkubations-/Wärmestress-Embryonen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>5.1-5.3</td>
			<td>1 h im Voraus</td>
			<td>Schalten Sie das Mikroskop und die Inkubationsphase ein.</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>5.4-5.10</td>
			<td>5 Min.</td>
			<td>Sandwich-Embryonen zwischen Coverlips für die Bildgebung.</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>5.11-6.6</td>
			<td>15 min-1+ h</td>
			<td>Bild intranukleare Aktin-Stäbe in Embryonen.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Vorschläge zur Fehlerbehebung. Diese Tabelle enthält Vorschläge zur Fehlerbehebung, um den erfolgreichen Abschluss des Protokolls zu unterstützen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Potenzielles Problem</td>
			<td>Vorschläge</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fliegen legen nicht genug Embryonen.</td>
			<td>Richten Sie den Becher mindestens 5 Tage im Voraus ein (siehe Schritte 1.1-1.3). Wechseln Sie die Teller 3x pro Tag, die zum Experiment führen, um die Eiablage zu fördern. Lassen Sie Fliegen Embryonen für 1 h statt 30 min legen. Stellen Sie Tassen mit jungen erwachsenen Fliegen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kein G-Actin wird aus der Mikronadel vertrieben.</td>
			<td>Erhöhen Sie die Druck- und Zeiteinstellungen für den Mikroinjektor. Brechen Sie die Mikronadelspitze weiter (siehe Schritt 4.5 Hinweis). Da große Verstopfungen möglicherweise nicht gelöscht werden, laden Sie eine neue Nadel.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Schwierig, eine kleine genug Blasengröße zu kalibrieren.</td>
			<td>Stellen Sie die Druck- und Zeiteinstellungen ein (siehe Schritt 4.5). Da die Mikronadelspitzenöffnung möglicherweise zu groß ist, laden Sie eine neue Nadel.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Embryonen lösen sich während der Injektion vom Kleber auf dem Deckel.</td>
			<td>Passen Sie die Konsistenz des "Embryoklebers" für zukünftige Abdeckungen an, indem Sie der Heptanlösung mehr doppelseitiges Klebeband hinzufügen (siehe Schritt 3.5 Hinweis).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Embryonen trocknen während der Temperaturinkubation aus.</td>
			<td>Stellen Sie sicher, dass die Rutsche in der Inkubationskammer eben ist (siehe Schritt 4.11) und dass das Öl nichts berührt, was es ableiten könnte. Fügen Sie den Embryonen zusätzliche Tropfen Öl hinzu. Verringern Sie die Austrocknungszeit vor der Injektion (siehe Schritt 3.8).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Öl deckt die Embryonen zwischen der ersten und der zweiten Abdeckung nicht vollständig ab.</td>
			<td>Fügen Sie dem kleinen Spalt zwischen den Deckellipsen zusätzliches Öl über Kapillarwirkung hinzu (siehe Schritt 5.8 Anmerkung).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intranukleare Aktinstäbe sind in hitzebelasteten Embryonen nicht sichtbar.</td>
			<td>Injizieren Sie ein größeres Volumen von G-Actin (siehe Schritt 4.5). Vergewissern Sie sich, dass die Temperatur sowohl der Inkubation nach der Injektion (siehe Schritt 4.11) als auch der Bildgebungskammer 32 °C beträgt (siehe Schritt 5.3).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Große Blasen von G-Actin sind rund um die Injektionsstelle von Embryonen sichtbar.</td>
			<td>Injizieren Sie ein kleineres Volumen von G-Actin (siehe Schritt 4.5). Erhöhen Sie die Austrocknungszeit des Embryos, um eine bessere Retention des injizierten Aktins im Inneren des Embryos zu fördern (siehe Schritt 3.8).</td>
		</tr>
</tbody></table>

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Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin in Drosophila-Embryonen zu injizieren und die intranukleare Aktinstabsmontage nach Hitzestress abzubilden.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3.4K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. Das Ziel dieses Protokolls ist es, Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin in Drosophila-Embryonen zu injizieren und die intranukleare Aktinstabsmontage nach Hitzestress abzubilden.

Serie: Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Neurowissenschaften

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Biologie

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Betrachtung von Mikrotubuli-Netzwerken in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mikrotubuli-Netzwerks in neuromuskulären Verbindungen von Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Upright-Imaging von

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Imaging Calcium in

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Zusammenfassung

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Upright-Imaging von

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Imaging Calcium in

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in