Gli autori ringraziano i membri del Laboratorio di Genomica del Cancro e Biocalcolamento delle Malattie Complesse per i loro acumesi input osservazionali e la loro partecipazione a molteplici discussioni in diverse fasi di questo progetto. Il sostegno finanziario include Israel Cancer Association (sovvenzione ICA per M.F-M 2017-2019) e sovvenzione Kamin dell'Israel Innovation Authority (per M.F-M.).

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La raccolta del sangue di un paziente in un tubo, la spedizione e lo stoccaggio sono i primi passi cruciali nella biopsia liquida. Una manipolazione impropria può compromettere la qualità del plasma e, pertanto, può interferire con i risultati della biopsialiquida 47. Se un campione di sangue viene raccolto in un tubo sanguigno EDTA, il plasma deve essere separato entro due ore dalla raccolta del sangue per evitare la lisi dei WBC e il rilascio del suo DNA genomico nel plasma4...

I progressi tecnologici hanno portato al sequenziamento di centinaia di genomi e trascrizioni tumorali1. Ciò ha contribuito a comprendere paesaggi di cambiamenti molecolari in diversi tipi dicancro 2. Ulteriori studi su questi paesaggi hanno contribuito a caratterizzare le alterazioni somatiche sequenziali e le fusioni gene-geniche3 che sono coinvolte nella progressione del cancro o del tumore, interrompendo serialmente le vie di apoptosi4. Pertanto, mutazioni somatiche e fusioni gene-geniche possono fornire informazioni sui tumori servendo come biomarcatori nei singoli pazienti per un particolare tumore ditipo 5,identificando la prognosi dei tumori primariesistenti 6,categorizzando i tumori secondari in base aicambiamenti molecolari 7e identificando i target tumorali farmacogable8. Tali informazioni possono facilitare la selezione di trattamenti personalizzati per i pazienti oncologici e la determinazione delle risposte positive e negative al trattamento9. Tuttavia, ottenere materiale tumorale per identificare la profilazione genomica del tessuto tumorale è una procedurainvasiva 10. Inoltre, una biopsia tumorale comprende solo una piccola parte di un tumore eterogeneo; e può, quindi, non essere rappresentativo per il profilo molecolare dell'intero tumore11. Il monitoraggio seriale e la genotipizzazione tumorale richiedono una raccolta ripetuta di tessuti tumorali, che, di solito, non è fattibile a causa dell'invasività della procedura di biopsia tumorale e dei problemi di sicurezza che derivano da taliprocedure 12.
La tecnica della biopsia liquida, d'altra parte, ha guadagnato un'enorme attenzione nell'oncologia diprecisione nell'ultimo decennio 13,14. Ciò è dovuto principalmente alla non invasività di questa tecnica e alla possibilità che venga ripetuta in più punti di tempo, consentendo così una tecnica di monitoraggio facile da usare e sicura per i corsidi malattia 15,16. La biopsia liquida si basa su un fenomeno che le cellule tumorali si moltiplicano rapidamente, e contemporaneamente molte di esse subiscono apoptosi e necrosi. Ciò porta al rilascio di detriti cellulari apoptotici nel sangue dei pazienti, insieme ai frammenti di DNA che vengono tagliati a dimensioni precise durante l'apoptosi17. L'apoptosi delle cellule non cancerose porta anche al rilascio dei suoi detriti cellulari nel sangue, tuttavia, il tasso di apoptosi in queste cellule è relativamente molto inferiore alle cellule tumorali18. Il razionale della tecnica della biopsia liquida è quello di catturare molecole associate al tumore come DNA, RNA, proteine e cellule tumorali14,19 che circolano continuamente nel sangue. Varie tecniche20 possono essere utilizzate per l'analisi di queste molecole tra cui il sequenziamento di nuova generazione (NGS), la reazione a catena della polimerasi a goccia digitale (ddPCR), la PCR in tempo reale e il saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA). La tecnica della biopsia liquida consente di identificare i biomarcatori che sono caratteristiche delle cellule tumorali. Queste molecole di biomarcatore non vengono rilasciate solo da parti specifiche di un tumore, ma piuttosto da tutte le parti del tumore21. Pertanto, i marcatori identificati nella biopsia liquida rappresentano il profilo molecolare di un intero tumore eterogeneo, oltre ad altri tumori nel corpo, avendo così vantaggi rispetto alla tecnica a base di biopsia tissutale22.
Il cfDNA ha un breve periodo di emidità nel sangue circolante che va da pochi minuti a 1-2 ore23. Tuttavia, il breve periodo di emidità del cfDNA facilita le analisi in tempo reale valutando la risposta al trattamento e le valutazioni dinamiche del tumore. I livelli di CFDNA derivati dal tumore indicano la prognosticazione dello stadio/dimensione tumorale evidenziata da diversi studi, che hanno mostrato una relazione tra i livelli di CFDNA e gli esiti disopravvivenza 24. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che il cfDNA ha una capacità di previsione migliore rispetto ai marcatori tumoraliesistenti 25. La prognosticazione del cfDNA è ancora più pronunciata dopo il trattamento del cancro, livelli più elevati di cfDNA dopo il trattamento sono ben correlati con un tasso ridotto di sopravvivenza e resistenza al trattamento. Mentre, livelli più bassi di cfDNA dopo la terapia corrispondono generalmente a una risposta positiva al trattamento. Inoltre, il cfDNA facilita la diagnosi precoce della risposta al trattamento rispetto ai metodi di rilevamento tradizionali.
Il cfDNA aumenta la possibilità di individuazione precoce delle mutazioni associate al cancro: durante la malattia in fase iniziale15, l'insorgenzadei sintomi 26 e prima della diagnosi di cancro fino a 2anni 27. Poiché cfDNA viene rilasciato da più regioni tumorali o focolai, la sua analisi fornisce una visione completa del genoma tumorale che rappresenta28. Pertanto, il cfDNA consente di rilevare mutazioni somatiche che potrebbero essere mancate nei campioni di tessuto29. Poiché l'eterogeneità intra-tumorale e le mutazioni subclonali possono essere rilevate sequenziando in profondità regioni genomiche che coprono migliaia di basi, quindi l'analisi del cfDNA consente di scoprire specifici sottotipi molecolari con distinte firme genomiche13. Per ottenere un livello simile di informazioni attraverso il campione di tessuto sarebbero state necessarie molte biopsie solide.
Inoltre, i livelli di cfDNA nei pazienti con una malattia localizzata come il cancro al colon, all'ovaio e al polmone dopo un trattamento chirurgico e / o chemioterapia, hanno dimostrato di essere un potente marcatore prognostico per la recidiva del cancro e gli esiti deltrattamento 20. Inoltre, nei pazienti con cancro al colon, al seno e al polmone, le analisi del cfDNA dal sangue potrebbero rilevare con successo i cambiamenti specifici del tumore, che hanno portato alla previsione precisa della recidiva con diversi mesi dianticipo 13. Inoltre, i marcatori di resistenza al trattamento, come le mutazioni KRAS in pazienti con CRC che ricevono terapia anti-EGFR30; VAF per geni come PIK3CA, MED1 o EGFR in pazienti con tumore al seno dopo il trattamento con varie terapie31; e la mutazione della resistenza EGFR T790M nei pazienti con cancro ai polmoni trattati con TKI32 mirati all'EGFR può anche essere identificata dall'analisi cfDNA.
In sintesi, l'analisi cfDNA può essere utilizzata per identificare biomarcatori precisi nel campo dell'oncologia13,33. In questo protocollo, campioni di sangue di 3 pazienti con glioma e 3 controlli sani sono stati elaborati per ottenere DNA genomico da WBC e cfDNA dal plasma. Nel cancro al glioma, le mutazioni in IDH , TERT, ATRX, EGFR e TP53 servono come marcatori diagnostici e prognostici che possono aiutare nella diagnosi precoce dei tumori del glioma, classificando diversi tipi di tumori del glioma, guidando il trattamento accurato per il singolo paziente e comprendendo la risposta altrattamento 34,35. Lo stato mutazionale di questi geni può essere identificato utilizzando cfDNA derivato dal sangue. In questo manoscritto, presentiamo un protocollo dettagliato di cfDNA derivato dal plasma che è stato utilizzato per studiare i cambiamenti mutazionali nel cancro al glioma12. Tale protocollo di biopsia liquida a base di CFDNA spiegato in questo articolo può essere utilizzato per studiare i cambiamenti mutazionali in molti altri tipi di tumori. Inoltre, un recente studio ha dimostrato che la biopsia liquida a base di CFDNA può rilevare 50 diversi tipi di cancro36.
La raccolta, lo stoccaggio e la spedizione dei campioni di sangue sono passaggi cruciali in questo protocollo, poiché la temperatura incontrollata durante questi passaggi causa lisi dei WBC, portando al rilascio di DNA genomico dal WBC nel plasma e causando la contaminazione del campione cfDNA, che influisce sul resto della procedura37. L'emolisi dovuta alla temperatura incontrollata può compromettere i processi di preparazione del campione a valle di cfDNA, come i passaggiPCR 38. Il siero contiene un'alta percentuale di cfDNA germinale piuttosto che plasma, sebbene presenti un grande rumore di fondo per cfDNA39associato al tumore . Pertanto, per isolare il cfDNA associato al tumore, il plasma è un campioneadatto 39. Il sangue prelevato in un antico coagulante contenente un tubo di raccolta del sangue deve essere centrifugato immediatamente o entro un massimo di due ore, per separare il plasma ed evitare la contaminazione da CFDNA. In questo protocollo vengono utilizzati tubi di raccolta del sangue di conservazione cfDNA commerciali dedicati (vedi Tabella dei materiali), che sono un'alternativa all'anticoagulante contenente tubi di raccolta del sangue. Questi tubi dedicati per la raccolta del sangue preservano cfDNA e cfRNA e prevengono la llisi dei WBC per un massimo di 30 giorni a temperatura ambiente e fino a 8 giorni a 37 °C. Ciò facilita il mantenimento della temperatura appropriata durante una spedizione del campione di sangue e fino a quando il plasma e il WBC nonsono separati 40.
Esistono attualmente tre tipi di metodologie di estrazione cfDNA: isolamento di fase, colonna di spin a base di membrana di silicio e isolamento magnetico basato su perline41. Il metodo della colonna di spin a base di membrana di silicio ha prodotto un'elevata quantità di cfDNA ad alta integrità rispetto ad altri metodi di estrazione cfDNA42.
La valutazione quantitativa del DNA è un requisito fondamentale nella biopsia liquida, è necessario sviluppare una procedura semplice, conveniente e standardizzata per la loro facile implementazione e ampio utilizzo. Tre metodi comunemente usati per la quantificazione cfDNA sono spettrofotometrici, fluorimetrici e qPCR. Il metodo fluorimetrico si è dimostrato migliore rispetto agli altri metodi riguardanti l'accuratezza, il costo e la facilità dicondotta 43.
L'integrità e la purezza del cfDNA possono essere stimate mediante elettroforesi di agarosio o elettroforesi capillare. L'elettroforesi dell'agarosio non mostra sensibilità a bassa concentrazione di cfDNA né ha un'alta risoluzione per mostrare una dimensione precisa del frammento di cfDNA. D'altra parte, l'elettroforesi capillare ha un vantaggio rispetto all'elettroforesi dell'agarosio superando le sfide associate e, quindi, ampiamente utilizzata dai ricercatori per l'analisi delle dimensioni dei frammenti cfDNA. In questo protocollo, la distribuzione delle dimensioni dei frammenti del cfDNA isolato è stata stimata utilizzando uno strumento automatizzato di elettroforesi capillare (vedi Tabella dei materiali).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Clip for Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5042-1398</td>
			<td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td>
			<td>Norgen Biotek Corp.</td>
			<td>63950</td>
			<td>Norgen&#39;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&#8212; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Cleaner Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for Gel Matrix</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>185-5990</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Basic Chip Vortex</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>MS-3-S36</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells 
			(e.g., bacteria), and many other sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac Connecting System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19419</td>
			<td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>84010</td>
			<td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (96&#8211;100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block or similar at 56 &#176;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (adjustable)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

Identificare le mutazioni nei tumori dei pazienti oncologici è un passo molto importante nella gestione delle malattie. Queste mutazioni fungono da biomarcatori per la diagnosi del tumore, nonché per la selezione del trattamento e la sua risposta nei pazienti oncologici. L'attuale metodo gold standard per rilevare le mutazioni tumorali comporta un test genetico del DNA tumorale attraverso biopsie tumorali. Tuttavia, questo metodo invasivo è difficile da eseguire ripetutamente come test di follow-up del repertorio mutazionale tumorale. La biopsia liquida è una tecnica nuova ed emergente per rilevare le mutazioni tumorali come approccio di biopsia facile da usare e non invasivo.
Le cellule tumorali si moltiplicano rapidamente. In parallelo, numerose cellule tumorali subiscono l'apoptosi. I detriti di queste cellule vengono rilasciati nel sistema circolatorio di un paziente, insieme a pezzi di DNA finemente frammentati, chiamati frammenti di DNA senza cellule (cfDNA), che portano mutazioni del DNA tumorale. Pertanto, per identificare i biomarcatori a base di CFDNA utilizzando la tecnica della biopsia liquida, i campioni di sangue vengono raccolti dai pazienti oncologici, seguiti dalla separazione del plasma e del mantello di buffy. Successivamente, il plasma viene elaborato per l'isolamento del cfDNA e il rispettivo strato di buffy viene elaborato per l'isolamento del DNA genomico di un paziente. Entrambi i campioni di acido nucleico vengono quindi controllati per verificarne la quantità e la qualità; e analizzato per le mutazioni utilizzando tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS).
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo dettagliato per la biopsia liquida, tra cui la raccolta del sangue, la separazione del plasma e del mantello di buffy, l'estrazione del DNA cfDNA e germinale, la quantificazione del DNA cfDNA o germinale e l'analisi dell'arricchimento dei frammenti cfDNA.

Separazione al plasma 8,5-9 ml di sangue raccolto in tubi conservanti cfDNA o cfRNA produce circa ~ 4 ml di plasma in volume. Il volume di plasma separato dal sangue raccolto nei tubi EDTA può variare a seconda della temperatura. L'esposizione di tubi EDTA contenenti sangue ad una temperatura superiore a 37 °C porta a una diminuzione della resa del volumeplasmatico 44.
Risultati saggio fluorometro La concentrazione di cfDNA nel ...

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Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

In questo articolo presentiamo un protocollo dettagliato per la tecnica della biopsia liquida non invasiva, tra cui la raccolta del sangue, la separazione del mantello plasmatico e buffy, l'estrazione del DNA cfDNA e germinale, la quantificazione del DNA cfDNA o germinale e l'analisi dell'arricchimento dei frammenti cfDNA.

Rilevamento di DNA privo di cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.8K Views.  Bar-Ilan University. In questo articolo presentiamo un protocollo dettagliato per la tecnica della biopsia liquida non invasiva, tra cui la raccolta del sangue, la separazione del mantello plasmatico e buffy, l'estrazione del DNA cfDNA e germinale, la quantificazione del DNA cfDNA o germinale e l'analisi dell'arricchimento dei frammenti cfDNA.

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Siero e Plasma copia numero rilevazione mediante PCR in tempo reale

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

Utilizzando 22 3 dell'anticorpo Anti-PD-L1 concentrarsi sulla biopsia e campioni di citologia dai malati di cancro del polmone Non a piccole cellule

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

Rilevamento di un pannello personalizzato di MicroRNA circolanti in pazienti con cancro colorettale metastatico

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Valutazione del rischio di cancro colorettale e della prevalenza da parte del rilevamento dell'integrità del DNA delle feci

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, protein amounts, or other relevant molecules. These methods have shown to be substantial alternatives to PCR or ELISA for clinical and research applications. Moreover, the detection of protein amount (by Western blot or immunohistochemistry) is often insufficient to provide information for cancer diagnosis, whereas the measurement of enzyme activity represents a valuable biomarker. Measurement of enzyme activity also allows for the diagnosis and potential treatment of pathogen-borne diseases. In all eukaryotes, topoisomerases are the key DNA-binding enzymes involved in the control of the DNA topological state during important cellular processes and are among the important biomarkers for cancer prognosis and treatment.
Over the years, topoisomerases have been substantially investigated as a potential target of antiparasitic and anticancer drugs with libraries of natural and synthetic small-molecule compounds that are investigated every year. Here, the rolling circle amplification method, termed rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay that allows for the quantitative measurement of topoisomerase 1 (TOP1) activity in a simple, fast, and gel-free manner is presented.By cleaving and ligating a specially designed DNA substrate, TOP1 converts a DNA oligonucleotide into a closed circle, which becomes the template for rolling circle amplification, yielding ~103 tandem repeat rolling circle products. Depending on the nucleotide incorporation during the amplification, there is the possibility of different readout methods, from fluorescence to chemiluminescence to colorimetric. As each TOP1-mediated cleavage-ligation generates one closed DNA circle, the assay is highly sensitive and directly quantitative.

A protocol for the sensitive and quantitative detection of topoisomerase 1 activity using the rolling circle enhanced enzyme activity detection assay is described. The method allows detection of topoisomerase 1 activity from purified components or cell/tissue extracts. This protocol has wide-ranging applications in any field involving detection of enzymatic activity.

Rilevazione semplice e veloce basata sull'amplificazione del cerchio di rotolamento dell'attività della topoisomerasi 1 in campioni biologici grezzi

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

Diagnosi del linfoma vitreoretinico mediante DNA libero da cellule

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To diagnose VRL, specimens such as vitreous humor and, more recently, aqueous humor are collected. Diagnostic testing for VRL on these specimens includes cytology, flow cytometry, and molecular testing. However, both cytopathology and flow cytometry, along with molecular testing using cellular DNA, necessitate intact whole cells. The challenge lies in the fact that vitreous and aqueous humor typically have low cellularity, and many cells get destroyed during collection, storage, and processing. Moreover, these specimens pose additional difficulties for molecular testing due to the high viscosity of vitreous humor and the low volume of both vitreous and aqueous humor. This study proposes a method for extracting cell-free DNA from vitreous and aqueous specimens. This approach complements the extraction of cellular DNA or allows the cellular component of these specimens to be utilized for other diagnostic methods, including cytology and flow cytometry.

Autore in primo piano: Avanzamento della diagnosi di VRL mediante l'estrazione di DNA libero da cellule dall'umor vitreo 

A procedure to extract cell-free DNA from vitreous and aqueous humor to perform molecular studies for diagnosing vitreoretinal lymphoma is established here. The method offers the ability to concurrently extract DNA from the cellular component of the sample or to reserve it for ancillary testing.

Estrazione di DNA senza cellule di campioni di vitreo e umor acqueo per la diagnosi e il monitoraggio del linfoma vitreoretinico

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...