Das hier gezeigte Protokoll kann helfen, die Biosynthese von Inositolpolyphosphaten von Pflanzen aufzuklären und Fragen zu ihrer Rolle bei bestimmten Aspekten des Pflanzenstoffwechsels und der Pflanzenentwicklung zu beantworten. Diese Methode ist hochsensibel, da die Verwendung des radioaktiv markierten Vorläufers von Inositolphosphaten einen zuverlässigen Nachweis aller Inositphosphatarten in Pflanzen ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die meisten Pflanzenbiologen mit der HPLC-Analyse und dem erforderlichen Setup nicht vertraut sind.
Darüber hinaus sind kritische Schritte dieses Protokolls, wie die Extraktion von Inositolphosphaten, ohne ordnungsgemäße Demonstration schwer zu befolgen. Beginnen Sie mit der Einrichtung eines Systems bestehend aus zwei unabhängigen HPLC-Pumpen, eine für Puffer A und eine für Puffer B. Beide Pumpen müssen gemeinsam über einen Computer oder eine Masterpumpe gesteuert werden. Implementieren Sie eine Kolbendichtungswäsche für beide Pumpen, entweder über Gravitationskraft oder über eine dritte Niederdruckpumpe.
Schließen Sie beide Pumpen an einen dynamischen Mischer an, und schließen Sie den Mischer dann mit einer Probenschleife mit einer Probenschleife an, die mindestens einen Milliliter Kapazität hat. Verwenden Sie Kapillaren, um das Einspritzventil mit der Säule und die Säule mit dem Fraktionskollektor zu verbinden. Seufzen Sie Lotussamen in einer Reihe auf quadratischen Petrischalen, gefüllt mit soliden Wachstumsmedien, die aus 0,8% bakteriologischem Agar in entionisiertem Wasser bestehen.
Lassen Sie die Samen für mindestens drei Tage bei vier Grad Celsius im Dunkeln zu schichten. Legen Sie die Samen in einen Wachstumsbrutkasten. Übertragen Sie 10 bis 20 Sämlinge in einen Brunnen einer 12-well-klaren flachen Bodenzellkulturplatte gefüllt mit zwei Millilitern halbfester MS-Salzlösung, die mit 1%Saccharose ergänzt und auf pH 5.7 eingestellt ist.
45 Mikrocurie von 3H Myo-Inositol auf die Platte geben und sanft wirbeln. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und versiegeln Sie sie mit mikroporösem chirurgischem Klebeband. Legen Sie es dann wieder in den Wachstums-Inkubator.
Nach fünf Tagen Etikettierung Sämlinge aus den Medien nehmen und kurz mit entionisiertem Wasser waschen. Trocknen Sie sie mit Papiertüchern und übertragen Sie sie in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, um sicherzustellen, dass das Rohr nicht überfüllt wird. Fangen Sie das Rohr in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius bis zur Extraktion.
Nehmen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und bewahren Sie sie in flüssigem Stickstoff auf, bis sie einsatzbereit sind. Schleifen Sie sie mit einem Mikrozentrifugenrohr-Pestle, bis sie anfangen zu tauen, dann fügen Sie 500 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer. Schleifen Sie weiter, bis die Probe homogenisiert und die Lösung gefärbt ist.
Zentrifugieren Sie die Proben für 10 Minuten bei 18.000 mal G und vier Grad Celsius. Dann den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Rohr geben. Die zur Gewinnung verwendeten Rohre gelten als feste radioaktive Abfälle und müssen entsprechend entsorgt werden.
Fügen Sie dem Extrakt vorsichtig 300 Mikroliter Neutralisationspuffer hinzu, was sofort zu Ausfällungen von Proteinen und Sprudeln führt. Mischen Sie die Probe nach einer Minute mit einer Pipettespitze und pipette fünf Mikroliter auf pH-Papier, um sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen sieben und acht liegt. Fügen Sie bei Bedarf kleine Mengen entweder Neutralisationspuffer oder Extraktionspuffer hinzu, bis der gewünschte pH-Wert erreicht ist, und lassen Sie die Proben mindestens eine Stunde lang mit offenem Deckel auf Eis ruhen.
Dann zentrifugieren Sie sie für 10 Minuten und übertragen Sie den Überstand in ein frisches 1,5 Milliliter Rohr. Den Fraktionssammler mit 96 kleinen Szintillationsfläschchen ausstatten und jede Durchstechflasche mit zwei Millilitern eines geeigneten Szintillationscocktails füllen, der mit niedrigen pH-Puffern und hohen Ammoniumphosphatkonzentrationen kompatibel ist. Starten Sie das HPLC-System, aktivieren Sie dann die Kolbendichtungswäsche und halten Sie sie während des gesamten Laufs aktiviert.
Die Probe manuell mit einer geeigneten Spritze injizieren. Starten Sie die Pumpen und den Farbverlauf. Während der HPLC-Lauf läuft, überprüfen Sie den Druck regelmäßig.
Der Startdruck sollte etwa 18 bis 24 bar betragen und langsam auf 50 bis 60 bar ansteigen, sobald 100% Puffer B erreicht ist. Nach dem Lauf die Fläschchen fest und kräftig schütteln die Fraktionen mit dem Szintillationscocktail zum Mischen. Wenn Sie nicht direkt mit der Messung fortfahren, halten Sie die Durchstechflaschen in einer aufrechten Position im Dunkeln.
Um die Fraktionen zu messen, legen Sie die Fläschchen in die Szintillationszählerracks ein, indem Sie Racks verwenden, die in die kleinen Fläschchen passen und jede Durchstechflasche für fünf Minuten in einem flüssigen Szintillationszähler messen. Bereiten Sie ein 2D-Liniendiagramm vor, in dem die gemessenen Zahlen pro Minute oder CPM auf die Aufbewahrungszeit geplottet werden. Um Stichproben miteinander zu vergleichen, normalisieren Sie die Daten, indem Sie das CPM aus jedem eluierten Bruch von Minute 25 bis 96 für jede einzelne Probe summieren und das gesamte CPM von dieser Probe durch das gesamte CPM der anderen Stichproben dividieren.
Um relative Quantifizierungen bestimmter Inositol-Polyphosphatspitzen durchzuführen und anschließend Stabdiagramme zu erstellen, die Replikationsdaten für statistische Analysen enthalten, setzen Sie die Analyse mit einer speziellen Software fort, die Spitzenbereiche von Chromatogrammen berechnen kann. Ein vollständiges Inositol-Polyphosphat-Spektrum, das nach der Szintillationszählung aus A.thaliana-Extrakten gewonnen wird, wird hier gezeigt. Die Peaks sind schön getrennt und können verschiedenen Isomern zugeordnet werden.
Wenn eine gealterte Säule verwendet wird, ist eine deutliche Reduktion von Inositol Hexakisphosphat und das Fehlen von Inositolpyrophosphat sichtbar. Die SAX-HPLC-Analyse wurde auch an L.japonica Sämlingen durchgeführt, die unter den gleichen Bedingungen wie die Arabidopsis Sämlinge angebaut und gekennzeichnet wurden. Während vermutlich alle Inositol-Polyphosphat-Arten und Spitzen, die von Arabidopsis bekannt sind, gesehen werden können, gibt es Unterschiede in den relativen Mengen spezifischer Inositol-Polyphosphat-Isomere zwischen den beiden Arten.
Um zu zeigen, dass Proben nicht unmittelbar nach der Extraktion analysiert werden müssen, wurde eine Probe in zweieinhalb davon geteilt, die am nächsten Tag nach der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius analysiert wurde. Die Unterschiede zwischen den SAX-HPLC-Profilen der frischen und gefrorenen Proben waren nicht signifikant, was zeigt, dass ein Frost-Tau-Zyklus der Probe nicht schadet und dass die Methode selbst reproduzierbare Ergebnisse liefert. Beim Versuch dieses Protokolls, schleifen Sie die Proben immer gründlich, gefroren und mit Extraktionspuffer, und zielen Sie auf eine nahezu neutrale pH nach neutraler Neutralisierung, um eine maximale Rückgewinnung von radio-markiertem Inositolphosphat für die SAX-HPLC-Analyse zu gewährleisten.
Es ist möglich, radiobeschriftete Funketiketten aus einem SAX-HPLC-Lauf für den späteren Gebrauch zu reinigen, z.B. in gegenseitigen Reaktionen, indem Fraktionen ohne Szintillationscocktails gesammelt und nur kleine Aliquots gemessen werden.
