Nukleoside und Nukleotide sind zentrale Stoffwechselkomponenten in allen lebenden Organismen. Der Stoffwechsel von ihnen ist für die Zellentwicklung erforderlich. Dieser Ansatz bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Quantifizierung dieser Metaboliten.
Diese Methode ermöglicht eine schnelle und genaue Quantifizierung von Nukleotiden und Nukleotiden in Pflanzen. Komplette Probenvorbehandlungen und LC-MS/MS-Analysen dauern etwa zwei Tage für einen Satz von 10 bis 20 Proben. Diese Methode kann auf alle Pflanzen und sogar andere Organismen angewendet werden.
Changhua Zhu, ein außerordentlicher Professor des Chen-Labors, wird das Verfahren demonstrieren. Um die Pflanzen zu züchten, stellen Sie sicher, dass Arabidopsis-Samen 10 Minuten lang in 70% Ethanol sterilisiert und auf Agarplatten mit 1/2 Stärke Murashige und Skoog Nährstoffen ausgesät werden. Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius und übertragen Sie sie dann in eine kontrollierte Wachstumskammer unter 16 Stunden Licht bei 22 Grad Celsius und acht Stunden Dunkelheit bei 20 Grad Celsius.
Ernten Sie 100 Milligramm zweiwöchige Setzlinge und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff für die Metabolitenextraktion ein. 100 Milligramm gefrorenes Pflanzengewebe mit sieben bis acht Stahlperlen in einer vorgekühlten Mischermühle fünf Minuten lang mit einer Frequenz von 60 Hertz mahlen. Bereiten Sie die Extraktionslösung vor, die Methanol, Acetonitril und Wasser in einem Verhältnis von zwei zu zwei zu eins enthält.
Die homogenisierten Materialien mit einem Milliliter der Extraktionslösung wieder aufsaugen. Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung bei 12.000 XG für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, geben Sie dann 0,5 Milliliter der Suspension in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein. Die gefrorene Probe in einem Gefriertrockner verdampfen und in 0,5 Milliliter 5% Acetonitril und 95% Wasser wieder auffüllen.
Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung bei 4.000 XG für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Laden Sie den Überstand zur LC-MS/MS-Messung in eine Durchstechflasche. Bereiten Sie einen 10 Millimolaren Ammoniumacetatpuffer vor, indem Sie 1,5 Gramm Ammoniumacetat in zwei Liter doppelt deionisiertem Wasser auflösen.
Stellen Sie den pH-Wert mit 10% Ammonium- und Acetatsäure auf 9,5 ein. Bereiten Sie zwei Liter hochreines 100% Methanol für die Nukleosidemessung vor und bereiten Sie dann zwei Liter hochreines Acetonitril für die Nukleotidmessung vor. Injizieren Sie 0,02 Milliliter der vorbehandelten Metabolitenextraktion jeder zuvor vorbereiteten Probe in ein HPLC-System mit Binärempumpumpen, gekoppelt mit einem dreifachen Vierfach-Massenspektrometer.
Um die Standardkalibrierungskurven zu generieren, gruppieren Sie sechs Probenextraktionen zusammen und wirbeln Sie die Mischung vor, dann aliquotieren Sie sie erneut auf sechs Extraktionen, um jeden Hintergrund zu erhalten. Fügen Sie diesen sechs Extraktionen sechs verschiedene Konzentrationen jedes Standards hinzu und injizieren Sie sie nacheinander in das HPLC-System. Erfassen Sie die Spitzenflächen jedes Standards in unterschiedlichen Konzentrationen über die Massenübergänge.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um N1-Methyladenosin, ein bekanntes modifiziertes Nukleosid, in zwei Wochen alten Arabidopsis-Wildtyp-Sämlingen zu identifizieren und zu quantifizieren. Das massenspektrometrische Profil zeigte, dass die aus dem N1-Methyladenosin-Standard erzeugten Produktionen im Verhältnis 150 und 133 MZ liegen. Und das gleiche Profil wurde bei der kolumbianischen Nullextraktion beobachtet.
Aufgrund der hohen Häufigkeit des Produktions von 150 MZ wurde für die N1-Methyladenosin-Identifizierung der Massenübergang von 282,1 bis 150 gewählt. Die Retentionszeit des Zielpeaks betrug 7,05 Minuten. Identisch mit der Retentionszeit des N1-Methyladenosin-Standards.
Eine Konzentrationsserie von N1-Methyladenosin-Standards wurde in sechs Probenextraktionen hinzugefügt. Die Standardproben wurden in die LC-MS/MS injiziert und die erhöhten Spitzenbereiche von N1-Methyladenosin wurden gegen die Nominalkonzentrationen der Standards aufgezeichnet. Die sechs gleichen Hintergrundextraktionen sind wichtig, um eine genaue und wiederholbare Kalibrierkurve für die Quantifizierung zu erstellen.
Unsere Methode kann angewendet werden, um Stoffwechselwege in Pflanzen zu erforschen. Durch den Vergleich der Metabolitenprofile zwischen Wildtyp- und Funktionsverlustmutanten konnte der Stoffwechselfluss gezogen werden.
