Diese Methoden können verwendet werden, um neuroinflammatorische und hämodynamische Reaktionen auf Hirnverletzungen im Rahmen einer multivariaten Systemanalyse unter Verwendung einer partiellen Regression der kleinsten Quadrate zu charakterisieren. Diese Techniken werden verwendet, um eine ganzheitlichere Sicht auf die Reaktion des Gehirns auf Verletzungen zu geben. Um eine Verletzung auszulösen, bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf Zehenquetschen bei einer betäubten Maus und platzieren Sie die Maus in der Bauchlage in der Mitte einer dünnen Membran.
Mit beiden Händen das gelehrte Gewebe halten, den Schwanz der Maus unter einem Daumen befestigen und unter dem Führungsrohr am Mauskopf positionieren. Wenn sich die Maus in Position befindet und auf den Aufprall zwischen der Rückseite der Augen und der Vorderseite der Ohren abzielt, lassen Sie die Schraube von der Oberseite des Führungsrohrs auf den dorsalen Aspekt des Mauskopfes fallen. Beim Aufprall durchbricht die Maus das Gewebe und ermöglicht eine schnelle Beschleunigung des Kopfes um den Hals.
Lassen Sie die Maus nach der Verletzung sich in Rückenlage auf einem 37 Grad Celsius warmen Pad erholen. Nach einer zweiminütigen Stabilisierungsphase legen Sie den DCS-Sensor vorsichtig über die rechte Hemisphäre des Schädels der Maus, so dass sich die obere Kante des optischen Sensors mit dem Augenhintergrund und die Seite des Sensors entlang der Mittellinie ausrichtet. Legen Sie eine Hand über den Sensor, um ihn vor Raumlicht abzuschirmen und fünf Sekunden Daten zu erfassen.
Positionieren Sie dann den Sensor über der linken Hemisphäre neu und erfassen Sie fünf Sekunden Daten der linken Hemisphäre. Um die Produktion von multiplexten Zytokinen und Phosphoproteinen zu beurteilen, fügen Sie 150 Mikroliter gemischten Lysepuffer pro etwa drei Milligramm geerntetem tierischem Hirngewebe hinzu. Und verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze, um das Gewebe 15 bis 20 Mal mechanisch zu trituieren.
Legen Sie die homogenisierten Proben 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einen Rotator, bevor Sie die Gewebeablagerungen durch Zentrifugation sammeln. Überfüllen Sie die Überstände in neue Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben, um den verbleibenden Niederschlag zu entfernen. Übertragen Sie die Überstände auf neue Röhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mittels BCA-Assay nach Standardprotokollen.
Bereiten Sie 25 Mikroliter jeder Probe mit der optimalen Proteinkonzentration vor, die durch die lineare Bereichsanalyse in neuen Röhrchen bestimmt wurde. Verwendung von Assay-Puffer, um das Gesamtvolumen jeder Probe auf 25 Mikroliter zu normalisieren. Um eine Assay-Platte vorzubereiten, fügen Sie 200 Mikroliter Waschpuffer zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu und schütteln Sie die Platte auf einem Shaker für 10 Minuten mit 750 Umdrehungen pro Minute.
Dekantieren Sie am Ende der Inkubation den Waschpuffer und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch, um Rückstände zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter Assay-Puffer zu jeder Vertiefung hinzu, gefolgt von 25 zusätzlichen Mikrolitern Puffer zu den Hintergrundbohrungen. Fügen Sie 25 Mikroliter der verdünnten Proben zu den entsprechenden Probenvertiefungen hinzu und wirbeln Sie den Durchgang der gemultiplexten magnetischen Perlen für eine Minute ein, bevor Sie 25 Mikroliter der gründlich neu suspendierten Perlen zu jeder Vertiefung hinzufügen.
Wenn alle Perlen hinzugefügt wurden, verschließen Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler und bedecken Sie die Platte mit Folie für eine Inkubation über Nacht mit Schütteln bei zwei bis acht Grad Celsius. Legen Sie die Platte am nächsten Morgen auf einen Magnetabscheider und stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen mit den Magneten ausgerichtet sind. Dekantieren Sie nach zwei Minuten den Brunneninhalt mit der Platte, die noch am Magnetabscheider befestigt ist, und fügen Sie 200 Mikroliter Waschpuffer zu jedem Brunnen hinzu.
Nachdem Sie es zwei Minuten lang geschüttelt haben, legen Sie die Platte für zwei Minuten auf den Magnetabscheider. Dekantieren Sie dann den Brunneninhalt mit der Platte, die noch am Magnetabscheider befestigt ist, und waschen Sie die Platte mit frischen 200 Mikrolitern Waschpuffer pro Well, wie gerade gezeigt. Nach der zweiten Wäsche 25 Mikroliter Nachweisantikörper pro Vertiefung hinzufügen und mit Folie für eine einstündige Inkubation bei 750 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur neu bedecken.
Am Ende der Inkubation 25 Mikroliter Streptavidin Phycoerythrin in jede Vertiefung geben und die Platte für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur in den Shaker zurückbringen. Am Ende der Inkubation die Platte zwei Minuten lang auf den Magnetabscheider legen, bevor der Bohrlochinhalt dekantiert wird. Waschen Sie die Platte zweimal mit 200 Mikrolitern frischem Waschpuffer pro Waschgang und fügen Sie 75 Mikroliter der entsprechenden Antriebsflüssigkeit zu jeder Vertiefung hinzu.
Hängen Sie dann die Perlen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur wieder am Plattenschüttler auf und lesen Sie die Platten auf dem Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers ab. In dieser Analyse wurde der zerebrale Blutfluss vier Stunden nach der letzten Verletzung mit diffuser Korrelationsspektroskopie gemessen. Der zerebrale Blutflussindex und der mittlere zerebrale Flussindex für jede Hemisphäre können dann bestimmt werden.
Eine lineare Bereichsanalyse kann durchgeführt werden, um eine geeignete Proteinbelastungsmasse zu bestimmen, bevor Daten aus allen Proben gesammelt werden. Zytokindaten können aufbereitet werden, indem die Hintergrundmessungen von den Probendaten subtrahiert und dann Z-Score-Daten für jeden Anolith berechnet werden. Die partielle Regression der kleinsten Quadrate kann durchgeführt werden, indem ein Phagozyten-Mikroglia-Aktivierungsmarker oder eine andere Variable von Interesse als Antwortvariable und die Zytokinmessungen als Prädiktorvariablen verwendet werden.
Die Varimax-Rotation kann durchgeführt werden, um die Kovarianz der Daten auf latenter Variable mit den Aktivierungsmarkermessungen zu maximieren. Hohe Belastungsgewichte in latenter Variable eins entsprechen den Zytokinexpressionen, die am meisten mit einer hohen Expression des Aktivierungsmarkers assoziiert sind. Lineare Regressionen zwischen dem Aktivierungsmarker und den Zytokinen zeigen, dass diejenigen Zytokine mit den größten Belastungsgewichten in der latenten Variablen eins auch statistisch signifikant für diese Analyse waren.
Obwohl wir dieses Protokoll auf traumatische Hirnverletzungen konzentriert haben, sind diese Methoden weitgehend verallgemeinerbar auf die Untersuchung einer Fülle von pathologischen Zuständen, die das Gehirn betreffen. Wir verwenden diese Techniken, um uns zu helfen, beherrschbare Ziele zu identifizieren, die in zukünftigen Experimenten moduliert werden können, um kausale mechanistische Beziehungen herzustellen, und letztendlich mit dem Ziel, neuartige therapeutische Strategien für leichte traumatische Hirnverletzungen zu entwickeln.
