Die Autoren danken der Cystic Fibrosis Foundation, die diese Forschung finanziert hat, und MedImmune für die großzügige Spende von Anti-Psl0096-Antikörpern. Für diese Studie wurde die Bildgebung an der CAMiLoD-Bildgebungseinrichtung der University of Toronto durchgeführt.

Für die Entnahme und Lagerung von Sputumproben von menschlichen Probanden ist die Genehmigung des Research Ethics Board (REB) erforderlich. Die hier vorgestellten Studien wurden vom Krankenhaus für kranke Kinder REB#1000058579 genehmigt.
1. Sputum-Entnahme
<ol><li>Auswurf in einem sterilen Auffangbecher aufbewahren und sofort vor der Fixierung maximal 24 h bei 4 °C lagern. HINWEIS: Wenn das Sputum zu lange bei 4 °C ohne Fixierung belassen wird, kann dies zu einem Zellabbau führen, insbesondere zum Abbau der weißen Blutkörperchen. Eine Fixierung so schnell wie möglich wird bevorzugt.</li>
	<li>Überführen Sie die Sputumproben in ein steriles 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Den Sputumproben wird ein gleiches Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) zugesetzt. Wenn die Sputumprobe beispielsweise 0,5 ml beträgt, fügen Sie 0,5 ml 4 % PFA hinzu. Durch sanfte Umkehrung mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Sputum über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe, indem Sie 5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu je 2 ml fixiertem Sputum hinzufügen. HINWEIS: Für diesen Waschschritt ist keine Zentrifugation erforderlich.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. HINWEIS: Vermeiden Sie es, den Auswurf mit der Pipette aufzusaugen, indem Sie die Spitze vom Auswurf wegzeigen und die Oberflächenflüssigkeit sehr langsam absaugen. Der Waschschritt beinhaltet keine Zentrifugation, um die strukturelle Integrität der Sputumpfropfen nicht zu stören.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.7 noch zwei weitere Male.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet im 2-fachen Volumen von PBS mit 0,01 % (w/v) Natriumazid.</li>
	<li>Lagern Sie den Sputum bei 4 °C.</li>
</ol>2. MiPACT (Tissue Clearing Technique) Verarbeitung von Sputum
<ol><li>Entgasen Sie die Hydrogelkomponenten (30% 29:1 Acrylamid: Bis-Acrylamid, Härter und PBS) in einem verschlossenen Behälter mit einer anaeroben Packung vorher für 72 Stunden. HINWEIS: Die anaerobe Packung und der versiegelte Behälter sind notwendig, da Sauerstoff die Acrylamidpolymerisation hemmt. Alternativ kann Sauerstoff entfernt werden, indem dieser Schritt in einer anaeroben Haube durchgeführt wird, indem ein Vakuum an einen versiegelten Behälter angelegt wird oder indemN2-Gas durch das Acrylamidgemisch sprudelt.<ol><li>2 ml einer 30%igen 29:1-Acrylamid:Bis-Acrylamid-Lösung in ein 15-ml-Röhrchen mit abgenommener Kappe im versiegelten anaeroben Behälter geben.</li>
		<li>Stellen Sie einen konzentrierten Härter mit 10 % (w/v) her, indem Sie 0,5 g Härter zu 5 ml PBS in einem 15-ml-Röhrchen hinzufügen. Lassen Sie die Kappe vom Röhrchen und bewahren Sie sie in dem verschlossenen anaeroben Behälter auf.</li>
		<li>Lassen Sie ein paar ml steriles PBS in einem Röhrchen mit abgenommener Kappe im anaeroben Behälter.</li>
	</ol></li>
	<li>5 ml Hydrogellösung mit einer Endkonzentration von 0,2 % Härter und 4 % 29:1 Acrylamid:bis-acrylamid in PBS in einem 15 ml-Röhrchen herstellen. Durch Invertieren mischen und filtern Sie sie.</li>
	<li>Sputumproben aus dem Kühlschrank nehmen und dann unter sterilen Bedingungen mit einem Skalpell in kleine Abschnitte (ca. 5 mm Durchmesser) schneiden. HINWEIS: Wenn der Auswurf recht flüssig ist, kann dieser Schritt trotzdem durchgeführt werden, es erfordert jedoch mehr Geduld und Übung, um den Auswurf mit einer Pinzette aus der Aufbewahrungslösung zu entfernen, bevor Sie das Skalpell verwenden, um die gewünschten Fraktionen zu trennen.</li>
	<li>Legen Sie die geschnittenen Sputumproben in eine Vertiefung eines Objektträgers mit 8 Kammern.</li>
	<li>Geben Sie 300 μl filtersterilisierte Hydrogellösung aus Schritt 2.2 in jede der Vertiefungen, die Sputum enthalten.</li>
	<li>Legen Sie das 8-Kammer-Deckglas für 3 Stunden bei 37 °C in einen verschlossenen Behälter mit einer anaeroben Packung. HINWEIS: Nach der Polymerisation sollte das Hydrogel mit eingebettetem Sputum die Konsistenz eines festen Gels haben.</li>
	<li>Die erstarrten Hydrogel-Sputumproben werden in ein 15-ml-Kulturröhrchen mit 5 ml 8%igem Natriumdodecylsulfat (SDS) mit einem pH-Wert von 8 überführt und die Proben 3-14 Tage lang bei 37 °C (mit oder ohne Schütteln) klären lassen, bis das Sputum transparent wird. HINWEIS: Die Reinigungszeiten hängen von der Zusammensetzung des Sputums ab und können im Allgemeinen durch Schütteln verkürzt werden. Achten Sie jedoch darauf, die Schüttelgeschwindigkeit nicht so weit zu erhöhen, dass die Integrität der Probe beeinträchtigt wird. DNA-reichere Proben brauchen im Vergleich zu schleimreichen Proben länger, um entfernt zu werden.</li>
	<li>Die 8%ige SDS-Lösung in einen Abfallsammelbehälter umfüllen. Mit einer sterilen Pinzette wird jede in Hydrogel eingebettete Probe in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen übertragen. Geben Sie 10 ml PBS in jedes der konischen 50-ml-Röhrchen, um die Hydrogele zu waschen, und lassen Sie die Lösung vor dem Umfüllen 30 Minuten bis 1 Stunde einwirken. Wiederholen Sie dies noch 2x mehrmals. HINWEIS: Dieser Waschschritt beinhaltet keine Zentrifugation. Überschüssige Flüssigkeit und Überstand werden vorsichtig mit einer Pipette entfernt.</li>
	<li>Gewaschene Proben werden in PBS mit 0,01 % (w/v) Natriumazid und 1x RNase-Inhibitor bei 4 °C gelagert.</li>
</ol>3. Protokoll der Hydrogel-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
<ol><li>Nehmen Sie die Hydrogel-Proben mit einer sterilen Pinzette aus ihrer Aufbewahrungslösung und legen Sie die Proben auf eine sterile Oberfläche (z. B. einen Objektträger oder eine Petrischale).</li>
	<li>Schneiden Sie die Hydrogele mit einem sterilen Skalpell in ~ 1 mm dicke Scheiben.</li>
	<li>Legen Sie die 1 mm dicken Abschnitte des Hydrogels in sterile 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 ml den Hybridisierungspuffer (25 % Formamid, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01 % SDS, gereinigtes und deionisiertesH2O) in einem 1,5-ml-Röhrchen vor.</li>
	<li>Die fluoreszenzmarkierte PseaerA-Sonde (150,7 nM12) wird in den Hybridisierungspuffer gegeben und durch Inversion gemischt. HINWEIS: Formalinlösung sollte von einer offenen Flamme ferngehalten werden. Der Hybridisierungspuffer kann im Voraus hergestellt und in Aliquoten bei -20 °Cgelagert werden 13.</li>
	<li>Geben Sie 200-500 μl Hybridisierungspuffer zu jedem ~1 mm Abschnitt des Hydrogels hinzu und stellen Sie sicher, dass die gesamte Hydrogelprobe untergetaucht ist.</li>
	<li>Lassen Sie die PseaerA-Sonde mit den Hydrogelproben hybridisieren, indem Sie sie ~ 18-24 h lang bei 46 °C im Dunkeln platzieren, ohne sie zu schütteln.</li>
	<li>Dekantieren Sie den Hybridisierungspuffer in einen Abfallsammelbehälter.</li>
	<li>Spülen Sie die Proben einmal mit filtersterilisiertem Waschpuffer (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) [pH 7,2], 0,01 % SDS und gereinigtem und deionisiertemH2O), indem Sie 1 ml Waschpuffer in jedes der 1,5-ml-Röhrchen geben und dann entfernen. HINWEIS: Der Waschpuffer kann im Voraus hergestellt und bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml frischen Waschpuffer in die Röhrchen und inkubieren Sie die Proben dann 6 h lang im Dunkeln bei 48 °C, ohne zu schütteln.</li>
</ol>4. Bindung von Hydrogel und Psl0096-Antikörpern
<ol><li>Entfernen Sie den Waschpuffer steril mit einer 1-ml-Pipette.</li>
	<li>Spülen Sie die Proben mit einer 2%igen BSA (w/v) in PBS-Lösung, indem Sie 1 ml der 2%igen BSA-Lösung hinzufügen und entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 500 μl der 2%igen BSA/PBS-Lösung zu den Hydrogelproben, um die unspezifische Proteinbindung zu blockieren. Inkubieren Sie die Proben dann über Nacht, im Dunkeln, bei RT, ohne zu schütteln.</li>
	<li>Steril entfernen Sie die Blockierungslösung mit einer 1-ml-Pipette.</li>
	<li>Bereiten Sie die Antikörperlösung Psl0096-Texas Red vor, indem Sie den Antikörper auf eine Endkonzentration von 0,112 μg/ml in 500 μl frischem 2%igem BSA/PBS verdünnen.</li>
	<li>Geben Sie die 500 μl Antikörperlösung zu den Hydrogelproben und inkubieren Sie sie bei RT für 6 h, lichtgeschützt, ohne zu schütteln.</li>
</ol>5. DAPI (4′,6′-Diamidino-2-phenylindol)-Färbung
<ol><li>Die Brechungsindexanpassungslösung (RIMS) wird hergestellt, indem 40 g nichtionisches Dichtegradientenmedium, 30 μl Tween20, 3 μg Natriumazid und 30 ml PBS in einen Kolben mit einem magnetischen Rührstab gegeben werden. Rühren Sie die Lösung 15 Minuten lang auf einem Magnetrührer oder bis sie sich vollständig aufgelöst hat.</li>
	<li>Der Filter sterilisiert die Lösung mit einer 10-ml-Spritze und einem sterilen 0,2-μm-Filter in ein konisches 50-ml-Röhrchen. HINWEIS: Die Lösung kann bei 4 °C mehrere Monate gelagert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Antikörperlösung Psl0096-Texas Red mit einer sterilen 1-ml-Pipette.</li>
	<li>Spülen Sie die Hydrogelproben ab, indem Sie 1 ml PBS hinzufügen und dann entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Hydrogelproben mit 250 μl RIMS-Lösung und 10 μg/ml DAPI bei RT mit leichtem Schütteln, im Dunkeln, über Nacht.</li>
	<li>Montieren Sie die Proben vor der konfokalen Bildgebung auf 0,9 mm oder 1,7 mm Perfusionskammern und versiegeln Sie sie mit einem Deckglas. HINWEIS: Nach FISH und/oder Immunhistochemie und vor dem Eintauchen in RIMS können fluoreszierende Lektinfärbungen angewendet werden, wenn eine Visualisierung des Sputumschleims gewünscht wird12.</li>
</ol>6. Bildgebung
<ol><li>Führen Sie konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung mit Standardtechniken bei 25-facher, 40-facher, 63-facher oder 100-facher Vergrößerung durch.</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity.">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).</li></ol>

Der Zweck dieses Protokolls ist es, einen Einblick in die in-situ Organisation von P. aeruginosa-Zellen im Sputum von Mukoviszidose-Patienten zu ermöglichen. Sputumproben sollten bis zur Verarbeitung bei 4 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort fixiert werden können. Es wurde gezeigt, dass sich die Zellzahlen von P. aeruginosa im Sputum nicht signifikant ändern, wenn sie bei 1 h, 24 h oder 48 h verarbeitet werden, wenn sie bei 4 °C gelagert werden, obwohl die Bakterienzellzahl bei 25 °C für 24...

In dieser Studie wurden Experimente durchgeführt, um die in vivo Struktur von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von pädiatrischen Mukoviszidose-Patienten (CF) sichtbar zu machen. P. aeruginosa-Infektionen werden bei 30-40% der pädiatrischen Mukoviszidose-Bevölkerung chronisch; Wenn sich chronische Infektionen erst einmal etabliert haben, sind sie fast unmöglich zu beseitigen1. P. aeruginosa-Isolate von Patienten mit früher Infektion sind im Allgemeinen anfälliger für antimikrobielle Mittel, daher werden diese mit anti-pseudomonalen Antibiotika behandelt, um die Etablierung einer chronischen Infektion zu verhindern2. Leider werden nicht alle P. aeruginosa-Isolate nach einer Antibiotikatherapie effektiv aus der Lunge entfernt. Die genauen Mechanismen, die mit dem Versagen von Antibiotika verbunden sind, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Variationen in der Zelldichte, der Aggregation und der Polysaccharidproduktion die Wirksamkeit von Antibiotika beeinträchtigen können3. P. aeruginosa produziert drei extrazelluläre Polysaccharide: Pel, Psl und Alginat4. Die meisten Stämme von P. aeruginosa haben die genetische Fähigkeit, jedes der Exopolysaccharide zu exprimieren, obwohl oft ein Polysaccharidtyp überwiegend exprimiert wird5. Das Exopolysaccharid Alginat ist mit chronischen Infektionen in der Mukoviszidose-Lunge assoziiert, was zu einem mukoiden Phänotyp 6,7 führt. Die Polysaccharide Pel und Psl haben mehrere Funktionen, darunter die Unterstützung der anfänglichen Anheftung und der Aufrechterhaltung der Biofilmstruktur sowie die Verleihung von Antibiotikaresistenz8.
Methoden zur Visualisierung von In-vivo-Strukturen von Geweben wurden für eine Vielzahl von Probentypen entwickelt 9,10,11. In jüngerer Zeit wurden sie darauf zugeschnitten, mikrobielle Gemeinschaften in vivo im Sputum von Mukoviszidose-Patienten sichtbar zu machen12. Die Optimierung eines Gewebe-Clearing-Protokolls speziell für die Identifizierung von mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb des Sputums wurde von DePas et al., 201612 entwickelt. Der Begriff MiPACT, der für Mikrobial identification after Passive CLARITY technique steht, wurde für die Klärung von Mukoviszidose-Sputumgeprägt 11,12. Bei Gewebereinigungstechniken werden die Proben zunächst fixiert und dann transparent gemacht, wobei ihre inhärente Architektur für die Färbung und mikroskopische Visualisierung intakt bleibt11. Die Fixierung und Klärung von Mukoviszidose-Sputumproben ermöglicht es den Forschern, Fragen im Zusammenhang mit der Biofilmstruktur, der bakteriellen Zelldichte, polymikrobiellen Assoziationen und Assoziationen zwischen Krankheitserregern und Wirtszellen zu beantworten. Der Vorteil der direkten Untersuchung von Bakterien, die im Sputum konserviert wurden, besteht darin, dass sie in einem wirtsspezifischen Kontext analysiert und visualisiert werden können. Obwohl die In-vitro-Züchtung klinischer Isolate im Labor für Experimente sehr aufschlussreich sein kann, sind solche Methoden nicht in der Lage, die Mukoviszidose-Lungenumgebung vollständig nachzubilden, was zu einer Diskrepanz zwischen Laborergebnissen und Patientenergebnissen führt.
Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um Sputum zu fixieren und zu reinigen, um Bakterien sichtbar zu machen, sei es von Mukoviszidose-Patienten oder Patienten mit anderen Atemwegsinfektionen. Die spezifische Art der Färbung und mikroskopischen Analyse, die hier beschrieben wird, ist die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), gefolgt von der Bindung von Anti-Psl-Antikörpern innerhalb des Hydrogels und der anschließenden Analyse mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM). Nach der Gewebereinigung können auch andere immunhistochemische und mikroskopische Methoden angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Coverwell perfusion chambers</td><td>Electron Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.</td></tr><tr><td>VA-044 Hardener</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of pseudomonas aeruginosa within the sputum of cystic fibrosis patients

Die frühzeitige Erkennung und Eradikation von Pseudomonas aeruginosa in der Lunge von Mukoviszidose-Patienten kann das Risiko einer chronischen Infektion verringern. Die Entwicklung chronischer P. aeruginosa-Infektionen ist mit einer Abnahme der Lungenfunktion und einer erhöhten Morbidität verbunden. Daher besteht ein großes Interesse an der Aufklärung der Gründe für das Scheitern der Eradikation von P. aeruginosa mit einer antibiotischen Therapie, die bei etwa 10-40% der pädiatrischen Patienten auftritt. Einer von vielen Faktoren, die die Wirtsclearance von P. aeruginosa und die Antibiotikaempfindlichkeit beeinflussen können, sind Variationen in der räumlichen Organisation (z. B. Aggregation oder Biofilmbildung) und der Polysaccharidproduktion. Daher waren wir daran interessiert, die in situ Charakteristika von P. aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten sichtbar zu machen. Eine Gewebereinigungstechnik wurde auf Sputumproben angewendet, nachdem die Proben in eine Hydrogelmatrix eingebettet wurden, um die 3D-Strukturen relativ zu den Wirtszellen zu erhalten. Nach der Gewebereinigung wurden fluoreszierende Markierungen und Farbstoffe hinzugefügt, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Bakterienzellen, Bindung von fluoreszenzmarkierten Anti-Psl-Antikörpern zur Visualisierung des Exopolysaccharids und DAPI-Färbung zur Färbung von Wirtszellen, um strukturelle Einblicke zu erhalten. Diese Methoden ermöglichten die hochauflösende Bildgebung von P. aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie.

Das Gesamtdesign des Experiments ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 zusammengefasst. Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung der Protokolle für die Sputumverarbeitung und die Sputumreinigung. Die Sputumbearbeitung und -reinigung kann bis zu 17 Tage dauern. Das Protokoll kann jedoch gestoppt werden, und die Proben können nach der Fixierung mit PFA (Tag 2) oder nach der Gewebereinigung (Tage 5-17 je nach Reinigungszeit) gelagert w...

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Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Dieses Protokoll bietet Methoden zur Visualisierung von Bakterienzellen und Polysaccharid-Syntheselocus (Psl)-Polysacchariden im Sputum von Mukoviszidose-Patienten.

Visualisierung von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

visualization-pseudomonas-aeruginosa-within-sputum-cystic-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

3.0K Aufrufe.  Hospital for Sick Children. Dieses Protokoll bietet Methoden zur Visualisierung von Bakterienzellen und Polysaccharid-Syntheselocus (Psl)-Polysacchariden im Sputum von Mukoviszidose-Patienten.

Serie: Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

Antibiotika-Wirksamkeitstests in einem Ex-vivo-Modell von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus Biofilmen in der Mukoviszidose-Lunge

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

Werkzeuge zur Echtzeitbewertung eines Pseudomonas aeruginosa-Infektionsmodells

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

<meta charset="utf8"></head><body>Anpassbares CF-Modell für antimikrobielle Tests und mikrobielle Dynamikanalysen

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

Visualisierung von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten

Zusammenfassung

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Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet

Langzeitchronik

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Antibiotika-Wirksamkeitstests in einem Ex-vivo-Modell von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus Biofilmen in der Mukoviszidose-Lunge

Werkzeuge zur Echtzeitbewertung eines Pseudomonas aeruginosa-Infektionsmodells

Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose

Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose

Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose