Gehirnscheibenexperimente ermöglichen das Verhören der neuronalen Funktion mit hoher elektrischer und zeitlicher Auflösung, aber diese Scheiben trennen in der Regel viele präsynaptische Verbindungen. Eine keilförmige Scheibe hält eine intaktere präsynaptische Schaltung aufrecht. Diese modifizierte Gehirnscheibe unterhält einen vollständigeren in vivo-ähnlichen neuronalen Kreislauf und bietet gleichzeitig die Vorteile von In-vitro-Experimenten, wie z. B. visuell geführte Patch-Klemmenaufzeichnungen, Pharmakologie und Aktivitäts-Bildgebung.
Genaue Keilschnittgeometrie kann anhand der Atlaspositionen der Neuronen innerhalb des Schaltkreises geschätzt werden, aber die Integrität der präsynaptischen Schemata und Axone sollte mithilfe der Histologie bestimmt werden. Beginnen Sie mit einer Rasierklinge, um die Haut an der Mittellinie des Schädels von der Nase bis zum Nacken zu schneiden. Schälen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen und beginnend an der Basis des Schädels und weiter in Richtung der Nase, verwenden Sie eine kleine Schere, um einen Schnitt in den Schädel durch die Mittellinie zu machen.
An der Lambda-Nähte, machen Schnitte im Schädel von der Mittellinie seitlich in Richtung des Ohres auf beiden Seiten, um den Schädel zurück zu schälen, um das Gehirn zu belichten. Beginnend am rostralen Ende, verwenden Sie einen kleinen Laborspachtel, um das Gehirn sanft aus dem Schädel zu heben, damit die Sehnerven abgetrennt werden können. Fahren Sie fort, das Gehirn sanft nach hinten zu arbeiten, die ventrale Oberfläche freizulegen und feine Zangen zu verwenden, um die trigeminalen Nerven in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms vorsichtig zu kneifen, um sie zu schneiden.
Legen Sie die Zubereitung in eine glasierte Petrischale, die mit kalter Schneidlösung gefüllt ist, und legen Sie die Schale unter ein Seziermikroskop. Trimmen Sie die Gesichtsnerven in der Nähe des Hirnstamms, um die Vestibulocochlea-Nerven freizulegen. Verwenden Sie feine Zange, um die Spitzen in die Foramina zu schieben, wo der Vestibulocochlea-Nerv den Schädel so weit wie möglich verlässt.
Pinch, um die Nerven auf beiden Seiten zu trennen, so dass die Nervenwurzel am Hirnstamm befestigt. Entfernen Sie die Hirnhaut und Vaskulatur von der ventralen Oberfläche des Hirnstamms in der Nähe des Trapezkörpers. Dann kneifen Sie die verbleibenden Hirnnerven und Bindegewebe, um das Gehirn vollständig aus dem Schädel zu befreien, wobei Sie darauf achten, das verbleibende Rückenmark zu erhalten, wenn möglich.
Um die Oberfläche des Gehirns für die Fixture auf die Bühne vorzubereiten, stellen Sie die Hirnventralseite nach oben und verwenden Sie ein stumpfes Werkzeug, um das Rückenmark sanft zu immobilisieren, um das Gehirngewebe zu stabilisieren. Setzen Sie offene Zangen in einem etwa 20-Grad-Winkel durch das Gehirn an den Boden der Schale, so dass die Spitzen verlassen die dorsale Oberfläche des Gehirns kaudal zum optischen Chiasm und verwenden Sie eine Rasierklinge entlang der Zange zu schneiden. Als nächstes bereiten Sie einen einen Kubikzentimeter Block von 4%Agar vor und verteilen einen kleinen Tropfen Kleber in ein Rechteck auf der Bühne.
Verwenden Sie Zangen, um das Gehirn vorsichtig zu heben und sanft die überschüssige Flüssigkeit mit dem Rand eines Papiertuchs zu tappen. Legen Sie dann die blockierte Oberfläche auf den Kleber, so dass die ventrale Oberfläche während des Schneidens in Richtung der Klinge gerichtet ist und den Agarblock als Stütze sanft gegen die rückende Oberfläche drückt. Um Keilscheiben mit der Cochlea-Nervenwurzel auf der dicken Seite und den medialen Olivocochlearen und dem medialen Kern des Trapezkörpers auf der dünnen Seite zu erwerben, legen Sie die Magnetscheibe mit dem angeschlossenen Gehirn auf den Bühnenhalter und legen Sie den Halter in die Schnittkammer eines Vibratome mit der ventralen Oberfläche des Gehirns, die auf die Klinge ausgerichtet ist.
Füllen Sie die Kammer mit eiskalter Schneidlösung und senken Sie die Klinge in die Carbogenblasenlösung. Schneiden Sie Slices kaudal in den Bereich von Interesse, um sicherzustellen, dass die Scheiben symmetrisch sind. Dann verschieben Sie die Bühne etwa 15 Grad auf eine Seite.
Schneiden Sie vorsichtig weiter, bis die Hörnerbwurzel auf der einen Seite nahe an der Oberfläche ist und der Gesichtsnerv an der Oberfläche der anderen Seite der Scheibe zu sehen ist. Verschieben Sie die Bühne um 15 Grad zurück in die ursprüngliche Position und bewegen Sie die Klinge vom Gewebe weg. Drehen Sie die Bühnenbasis um 90 Grad, so dass die seitliche Kante der dünnen Seite der Klinge zugewandt ist, und senken Sie die Klinge mehrere hundert Mikrometer, bevor sie die Klinge langsam nahe an den Rand des Gewebes bringt.
Mit der Klinge etwas tiefer zurückgezogen die Klinge auf die gewünschte Dicke der dünnen Kante der Scheibe. Bewegen Sie die Klinge vom Gewebe zurück und drehen Sie die Bühnenbasis zurück, sodass die ventrale Oberfläche der Bühnenbasis zuzeigt. Machen Sie einen Schnitt, um die rostrale Oberfläche der Keilscheibe zu bestimmen und übertragen Sie die Scheibe auf ein Quadrat zentimetergroßes Stück Interface-Papier-Caudle-Oberfläche nach unten.
Der Gesichtsnerv sollte auf beiden Hemisphären der Scheibe auf der rostralen Oberfläche sichtbar sein. Dann bewegen Sie die Scheibe auf eine 35 Grad Celsius Inkubationskammer, um für 30 Minuten zu erholen. Um die Keilscheibe für die Elektrophysiologieanalyse einzurichten, legen Sie die Probe in eine Aufnahmekammer, die kontinuierlich mit 35 Grad Celsius ACSF durchlässig wird, und stabilisieren Sie die Scheibe.
Mit DIC-Optik, konzentrieren Sie sich auf die auditive Nervenwurzel auf der dicken Seite der Scheibe und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die bipolare Wolfram stimulierende Elektrode auf die auditive Nervenwurzel und sanft in die Oberfläche des Gewebes zu bewegen. Bewegen Sie das Sichtfeld auf den ventralen Kern des Trapezkörpers auf der dünnen Seite und wählen Sie ein mediales Olivocochlear-Neuron als Ziel für die Patchklemmenelektrophysiologie unter Epifluoreszenz mit einem 561 Nanometer-Emissionsfilter. Füllen Sie eine Aufnahmepipette mit der entsprechenden internen Lösung für das vorgeschlagene Experiment und unter DIC-Optik Patch und Aufnahme aus dem medialen Olivocochlear Neuron in der Ganzzellkonfiguration.
Passen Sie die elektrische Stimulationsamplitude der auditiven Nervenwurzel an, um konsistente postsynaptische Ereignisse im medialen Olivocochlear-Neuron zu erhalten. Führen Sie dann geeignete Stimulationsprotokolle aus, um evozierte synaptische Ströme in medialen Olivocochlearen-Neuronen zu beobachten. Dieses Keilscheibenpräparat ist so konzipiert, dass es die auditive Nervenwurzel und den Cochlea-Kern kontralateral zu den medialen Olivocochlearen-Neuronen enthält, die für Aufnahmen bestimmt sind.
In dieser kresylviolett gefärbten resektionierten Keilscheibe ist der Cochlea-Kern in fast seiner vollen rostral-kaudalen Ausdehnung vorhanden. Und die auditive Nervenwurzel wird beim Eindringen in den Cochlea-Kern beobachtet. Darüber hinaus enthält die Keilscheibe Neuronen des medialen Kerns des Trapezkörpers ipsilateral zu den medialen Olivocochlearen-Neuronen, aus denen Aufnahmen gemacht werden.
Um die neuronale Konnektivität innerhalb eines Keilscheiben präsynaptischen Inputs zu bestätigen, werden auf zwei Arten stimuliert. Zunächst wird die ventrale akustische Strie an der Mittellinie elektrisch stimuliert, die Direktaktivierung von T-Stellat-Axonen und des medialen Zellkerns der Trapezkörperneuronen mittels kugelförmiger Buschzell-Axonstimulation und resultieren zu postsynaptischen Strömen, die am medialen Olivocochlear-Neuron gemessen werden. Die auditive Nervenwurzel wird dann stimuliert, um die gesamte monaural aufsteigende Hirnstammschaltung zu aktivieren und postsynaptische Reaktionen zu evozieren.
Der Vergleich der beginnenden Latenzmessungen des ersten postsynaptischen Stroms, der mit direkter Stimulation der ventralen akustischen Stria mit denen evoziert wird, die mit auditiver Nervenstimulation evoziert werden, zeigt eine signifikant längere Latenz im auditiven Nervenstimulationsereignis, was auf die synaptische Verzögerung hindeutet, die sich aus der zusätzlichen Cochlea-Nucleus-Synapse ergibt, die während der auditiven Nervenstimulation aktiviert wird. Die Verwendung anatomischer Landmarken und das sorgfältige Manövrieren der magnetischen Scheibenstufe sind entscheidend für die Erstellung von Keilscheiben mit intakten neuronalen Schaltkreisen und zuverlässigevozierten postsynaptischen Reaktionen. Diese Schneidetechnik bietet eine Plattform für den Einsatz zusätzlicher in vitro elektrophysiologischer Werkzeuge, einschließlich Kalzium- oder Spannungsbildgebung, Optogenetik, Neurotransmitter-Unkaging und sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Pharmakologie.
