Diese Technik erleichtert die Visualisierung von Replisom-Antigen-markierten DNA-Addukt-Begegnungen und kann auf die Wechselwirkungen eines beliebigen Proteins mit einer DNA-Struktur oder -Läsion ausgeweitet werden, die für den Immunnachweis geeignet ist. Diese Methode kann verwendet werden, um Interaktionshäufigkeiten innerhalb einzelner Zellen und nicht über eine Population hinweg zu untersuchen, und ermöglicht die Visualisierung von zellzyklusabhängigen Interaktionen in situ, ohne Zellen zu schädigen. Ishani Majumdar, Postdoktorandin am Seidman Laboratory, demonstriert das Verfahren.
Am Tag vor dem Experiment werden 1,5 mal 10 bis fünfte Zellen in zwei Millilitern Medium auf 35 Millimeter große Glasbodenkulturschalen gesät, die mit Zellkleberlösung vorbehandelt sind. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand in jeder Schale durch 37 Grad Celsius Five mikromolaren Dig TMP-supplementiertes Medium in die 50 bis 70 % konfluenten Zellkulturen und geben Sie die Platten für 30 Minuten in den Zellkulturinkubator zurück, damit sich das Dig TMP ausgleichen kann. Während der Inkubation der Zellen wird eine UV-Box auf 37 Grad Celsius vorgewärmt.
Übertragen Sie die Platten am Ende des Äquilibrierens in die vorgewärmte Box, um die Zellen einer fünfminütigen UVA-Lichtdosis von drei Joule pro Quadratzentimeter auszusetzen, und ersetzen Sie die Überstände durch zwei Milliliter frisches, vorgewärmtes Nährmedium, bevor Sie die Platten für eine Stunde in den Zellkulturinkubator zurückgeben. Waschen Sie am Ende der Inkubation die Kulturen vorsichtig mit PBS und fixieren Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,1%igem Formaldehyd in PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation einmal mit PBS, bevor Sie die Zellen zweimal mit 80 Mikrolitern Zytoskelett-Extraktionspuffer behandeln, der mit RNase angereichert ist, für fünf Minuten bei Raumtemperatur pro Behandlung, um das Zytoplasma zu entfernen.
Nach der zweiten Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei Milliliter PBS, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter 4%igem Formaldehyd 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS fixieren. Nach der zweiten Fixierung werden die Zellen wie gezeigt dreimal mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Behandlung mit einem Milliliter kaltem 100%igem Methanol für 20 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal in zwei Millilitern PBS, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation in 80 Mikrolitern von fünf millimolaren Triton X-100 bei vier Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation behandeln Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 100 Mikrolitern fünfmillimolarem EDTA in PBS, ergänzt mit einem Mikroliter 100 Milligramm pro Milliliter RNase A. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal in PBS, bevor Sie sie in 5 % Kälberserumalbumin und 10 % Eselsserum in PBS über Nacht bei vier Grad Celsius in einer Feuchtkammer lagern. Um einen Proximity-Ligationstest durchzuführen, geben Sie 40 Mikroliter der primären Antikörperlösung von Interesse in die Mitte jeder Platte und inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang in der feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius.
Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal mit zwei Millilitern PBST, bevor Sie 40 Mikroliter frisch zubereitete PLA-Sondenlösung für eine einstündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator in jede Schale geben. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit drei 10-minütigen Waschgängen in zwei Millilitern Puffer A auf einer kippbaren Plattform bei Raumtemperatur. Nach dem letzten Waschgang geben Sie 40 Mikroliter frisch zubereitete Ligaturmischung für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius auf jede Platte, gefolgt von drei zweiminütigen Waschgängen in Puffer A auf der Kippplattform.
Geben Sie nach dem letzten Waschgang 40 Mikroliter frisch zubereitete Amplifikationslösung in jede Platte für eine 100-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation sechsmal mit frischem Puffer B für 10 Minuten pro Waschgang auf der Kippplattform. Waschen Sie die Zellen nach der letzten Puffer-B-Wäsche einmal mit 0,01-fachem Puffer B für eine Minute bei Raumtemperatur, bevor Sie sie mit den entsprechenden Sekundärantikörpern in der Feuchtkammer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius markieren.
Am Ende der Inkubation werden die Proben mit drei 10-minütigen Waschgängen auf einer Kippplattform in PBST bei Raumtemperatur gewaschen, bevor sie in ein mit DAPI ergänztes Eindeckmedium eingelagert werden. Innerhalb von vier Tagen nach der Montage mindestens 100 Beobachtungen pro Probe oder Bedingungszellen auf einem Epifluoreszenz- oder konfokalen Mikroskop abbilden, wobei die gleichen Belichtungseinstellungen für Versuchs- und Kontrollproben verwendet werden. Der Dig-Tag kann durch Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden, um das Vorhandensein von Interstrang-Querverbindungen im gesamten Zellkern aufzudecken.
Um die Wechselwirkung von Replisomen mit Interstrang-Crosslinks zu visualisieren, kann PLA verwendet werden, um die Häufigkeit der Assoziation von MCM5 und dem Dig-Tag eine Stunde nach der Einführung der Interstrang-Crosslink-Vernetzung zu visualisieren. Da Replikationsstress die ATR-Kinase aktiviert, ist die PLA zwischen pMCM und Serin 108 und dem Dig-Tag ebenfalls positiv. Die PLA-Ergebnisse einzelner Kerne können in einer dreidimensionalen Rekonstruktion dargestellt werden, die die Visualisierung von Replisom-Interstrang-Vernetzungsbegegnungen im gesamten Zellkern ermöglicht.
Die Replikationsgabelanalyse zeigt, dass Begegnungen mit Interstrang-Vernetzungen ein unerwartetes Phänomen des Replikations-Neustarts aufweisen, da die Proteine des GINS-Komplexes kein PLA-Signal mit den Interstrang-Querverbindungen aufweisen. Im Gegensatz dazu ist der Assay mit CD 45 positiv, was darauf hindeutet, dass das andere Locking-Protein erhalten bleibt. Wenn Zellen mit einem ATR-Inhibitor inkubiert werden, wird der Neustart vollständig unterdrückt und die GINS Dig PLAs stark positiv.
Die CSK+R-Behandlung ist für die Reduzierung des Hintergrundsignals unerlässlich. Achten Sie darauf, die Platten mit einem Zellkleber zu beschichten und mit 0,1 % FA zu versehen, da sich die Zellen sonst von der Platte ablösen.
