Die Autoren bedanken sich bei E. de la Rosa und AI Valenciano für erste Hilfe zu danken mit der Gründung der organotypischen Kulturen und U. Laub und U. Gerster für die technische Unterstützung.

Alle Geräte und Reagenzien sind gekauft sterile oder muss Wärme oder Dampf sterilisiert oder sterilisiert mit 70% EtOH werden. Die Autoren stellen fest, dass Tierversuche in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie (86/609/EWG) durchgeführt wurden, nach den Richtlinien der NIH zur Pflege und Verwendung von Tieren für experimentelle Verfahren und den Regularien der Institutional Tiere gesetzt Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der Universität Duisburg-Essen (Deutschland). Teil 1: Enukleation murine Augen der verschiedenen Entwicklungsstadien Enukleation der embryonalen Augen <ol><li> Zeit schwanger Paarungen aufgestellt und am Morgen des Tages, an dem ein Vaginalpfropf bei Frauen Paarung erkannt wird, ist Schwangerschaftswoche Tag 0 bezeichnet. </li><li> Die schwangere Frau ist durch Genickbruch getötet, wenn die Entwicklung des Embryos die gewünschte Stufe (hier: embryonale Tag (E) 15) erreicht hat und auf einer Wachs-Brett 6. </li><li> Die Bauchdecke wird mit 70% EtOH angefeuchtet, geschnitten entlang der Mittellinie und die Hautlappen werden seitlich durch Stifte 6 fixiert. </li><li> Die uterusses aus dem Bauch, gelöst und in ein Becherglas mit kaltem PBS 6 entfernt. </li><li> Die Embryonen werden getrennt, in eine Petrischale und Gebärmutterwand und embryonalen Membranen sind sorgfältig durch die Verwendung von Zangen 6 entfernt. </li><li> Die Embryonen werden durch Enthauptung getötet. </li><li> Die Augen sind entkernte werden die Verwendung von feinen, gebogenen Pinzette, &quot;Peeling&quot; die Augen aus der Augenhöhle. </li></ol> Enukleation der postnatalen und adulten Augen <ol start="1" type="1"><li> Junge Welpen sind durch Enthauptung, älteren Jungtieren und Erwachsenen durch Genickbruch getötet. </li><li> Bis zu postnatalen Phase P15, haben den Zeitpunkt, wenn Mäuse ihre Augen öffnen, Sehschlitzen mechanisch durch den Einsatz von Zange geöffnet und erweitert durch zwei Querschnitte der Augenlider mit Feder Schere. </li><li> Die Augen sind durch die Hilfe einer gebogenen Pinzette entkernte, Druck auf die Umlaufbahn. </li></ol> Hinweis: Wie bei postnatalen Tag 2, der orbitalen Knochen noch Knorpel, ist es wichtig, nicht zu viel Druck ausüben, bei dem Versuch, die Augen zu entfernen. Im Gegensatz dazu in der erwachsenen Mäusen sind die orbitalen Knochen fest. So um die Augen entkernen ist es ausreichend, um Druck auf die Bahn ohne Vergrößerung der Sehschlitzen im Voraus bewerben. Teil 2: Präparation des embryonalen, postnatalen und adulten murinen Netzhaut Dissection der Netzhaut <ol><li> Die Augen sind in eine kleine Petrischale mit sterilem PBS und die umliegenden Auge Schichten unter einem Dissektionsmikroskop entfernt platziert. </li><li> Um das äußere Auge Schichten zu entfernen, in postnatalen Stadien und erwachsene Augen des Sehnervs hat durch die Hilfe des Frühlings Schere oder eingeklemmt abgeschnitten werden mit einer Pinzette an der Basis wie möglich zu schließen. </li><li> Drehen Sie die Augen, so dass die Rückseite mit dem Loch, wo der Sehnerv ursprünglich befanden Ihnen zeigt. Geben Sie den subretinalen Raum zwischen Netzhaut und Pigmentepithel mit den Spitzen von zwei sehr feinen Pinzette aus dem Ort, wo der Sehnerv das Auge eingedrungen Schichten. Hinweis: In der Regel das Pigmentepithel kann leicht durch seine dunkle Farbe identifiziert werden. In einigen Maus Mutanten - vor allem in Albino-Tiere - dieses Pigment-Schicht kann jedoch nicht eingefärbt werden und dürfen somit nicht ohne weiteres zu erkennen. </li><li> Entfernen Sie das Pigmentepithel mit dem beigefügten Aderhaut und Sklera durch vorsichtiges Reißen auf beiden Seiten mit beiden Zangen. </li><li> Ziehen Sie die Schichten bis auf die Ebene der Hornhaut, dann drehen Sie die Augenmuschel an der Linse Seite und entfernen Sie die Hornhaut mit Pigmentepithel, Chorioidea und Sklera, während Sie die restlichen Netzhaut-Cup und den anderen Pinzette. </li><li> Fassen Sie die Glaskörper zusammen mit der kleinen Linse und während Reißen mit einer Pinzette, halten Sie die Netzhaut wholemount statt mit der zweiten Zange. Hinweis: Wenn Sezieren embryonalen Augen, stellen Sie sicher, vollständig zu entfernen dreieckig, zeltartige Kapillarplexus unter dem Glaskörper zusammen mit dem Glaskörper. In der erwachsenen Auge, muss der Glaskörper an den Seiten fassen und Sorgfalt, um nicht zu durchbohren den Glaskörper mit den Spitzen der Pinzette, als sein Inhalt ist dickflüssig und klebt an der Zange, behindern ihre Entfernung getroffen. </li><li> Für organotypischen wholemount Kultur der Netzhaut Becher sind in einer 96-Well-Platte mit 200 ul Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (siehe unten) gesammelt. </li></ol> Hinweis: Zwischen Dissektion der einzelnen Netzhaut, halten Sie die 96-well-Sammlung Platte mit dem Kulturmedium in den Inkubator, wie der pH-Wert des Kulturmediums von CO 2 wird über das Carbonat-System ausgelöst. Teil 3: Murine organotypischen Retina wholemountKultur <ol><li> Bereiten Sie 500 ml Kultur durch die Gewichtung 7,8 g Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium / Nährstoffmischung F-12 HAM (DMEM) und 0,6 g NaHCO 3 und Auflösen sowohl in MiIliQ Wasser. Den pH-Wert auf 7,15. Add 50mg apo-Transferrin, 50 ul Putrescin (Bestand: 60mg/ml), 50 ul Natriumselenit (Bestand: 52μg/ml), Progesteron (Bestand: 60μg/ml) und 2,5 ml Gentamicin (200 mM) unter der Haube. Mix und durch ein Bottle Top-Filters. Unmittelbar vor der Verwendung hinzufügen 10 &amp;mgr; l Glutamin (200 mM) pro ml Kulturmedium. Hinweis: Dieses Serum-und Insulin-freiem Medium kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu 2 Wochen und für die Apoptose-Induktion Experimente wie kein Insulin wirkt der Effekte. Wenn Inkubation wholemounts länger als 24 Stunden gewünscht wird und Zelltod Preise werden nicht ausgewertet, Insulin-Serum (zB fötales Kälberserum; FCS) sollen oder Ergänzungen hinzugefügt, um die Überlebensraten zu verbessern. </li><li> Vor Beginn der Kultur, sind die retinalen wholemounts für 15 min bei 37 vorinkubiert ° C mit 200 ul warm, pH-neutral DMEM mit 0,5-Promillegrenze Hyaluronidase vor, verdauen die Hyaluronidase mit inneren und äußeren Grenzmembran M ller Glia Zellen, die Erleichterung Eindringen von exogen applizierten Substanzen. </li><li> Netzhaut sind eine 24-Well-Platte mit so wenig wie möglich Hyaluronidase und kultiviert wie organotypischen wholemounts in 2ml chemisch definierten Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium überführt. Hinweis: Für die Übertragung der Netzhaut, verwenden Sie eine 1ml Pipette und schneiden Sie die Pipettenspitze einige Millimeter, um die Öffnung zu erweitern. Für embryonalen Augen, ist ein 200 ul Pipettenspitze ausreichend. Die Schnittkanten sollten durch Einsetzen und Verdrehen eines zweiten Pipettenspitze geglättet werden. Für 24-48 Stunden kurzfristige Kulturen lassen sich alle Schritte bei der Bank durchgeführt werden, aber wenn eine Kontamination der Kulturen stellt sich heraus, ein Problem zu sein, sollte man unter der Motorhaube arbeiten. </li><li> 48 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Atmosphäre und pharmakologische Behandlung mit rekombinanten Faktoren unterworfen zB - Kulturen werden für 24 aufrechterhalten. </li></ol> Teil 4: Die Dissoziation von kultivierten retinalen wholemounts <ol><li> Nachdem die gewünschte Kultur der Zeit, sind Netzhaut in 2ml Eppendorf-Röhrchen mit rundem Boden enthält 850 ul PBS und 50 ul Rinderserumalbumin (; 30 mg / ml BSA) gesammelt. </li><li> Ort Eppendorf-Röhrchen mit einer Netzhaut in einem Heizblock, bis bei 37 ° C erhitzt </li><li> Add 25 ul Kollagenase (200 U / ml) und 25 ul Hyaluronidase (20mg/ml) in jede Eppendorf-Röhrchen und starten Sie distanziert die Netzhaut in einzelne Zell-Suspension von 3 durchläuft eine silikonisierte Pasteurpipette. </li><li> Fügen Sie 10 ul Trypsin (1mg/ml), für 3-5 min warten und dann langsam Pipette 3-5 mal rauf und runter mit silikonisierten Pasteurpipette mechanisch distanzieren Gewebe. </li><li> Fügen Sie 10 ul DNase I (5mg/ml), wieder warten, für 3-5 min, dann langsam Pipette 3-5 mal rauf und runter mit silikonisierten Pasteurpipette. Hinweis: Die Inkubationszeit für die enzymatische Dissoziation variiert und hängt von der Größe der Augen und der Entwicklungsphase bzw.. Überprüfen Sie die Stufe der enzymatischen Aufschluss des Gewebes durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. </li><li> Wenn die Zellsuspension wird nicht von jetzt homogen, sondern enthält noch große Zellaggregate, zusätzliche 10 pl Trypsin und 10 ul DNase I. </li><li> Wenn die Zellsuspension homogen ist, die Verdauung des Gewebes durch Zugabe von 10 ul EDTA (0,5 M) gestoppt wird, Eppendorf-Röhrchen sind aus dem Kaminofen und die Zellsuspensionen entfernt werden für 1h durch Zugabe von 1 ml frisches, eiskaltes 8% Paraformaldehyd fixiert (PFA) bei Raumtemperatur auf einem Schüttler Rotation. </li></ol> Teil 5: Das Waschen der dissoziierten Zellsuspensionen <ol><li> Die Zellsuspension wird 5 min bei 4 ° C und bei 0,2 rcf in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. </li><li> Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 1ml PBS mit 3mg/ml BSA resuspendiert. </li><li> Nach Wiederholung dieser Waschschritte zweimal wird das Pellet schließlich in 500 ul PBS 3mg/ml BSA, 5 mM EDTA und 0,1% Natriumazid resuspendiert. </li></ol> Hinweis: Der Zusatz von Natrium-Säure ermöglicht eine Lagerung der Zellsuspension für mehrere Tage bei 4 ° C. Wenn jedoch eine immunzytochemische Färbung werden folgen, fügen Sie nicht Natrium-Säure zum Resuspensionspuffer, da dies zum Verlust der Färbung Qualität. Teil 6: Cytospin von Zellsuspensionen für quantitative Apoptose und Proliferation Analyse <ol><li> Ein matt-End-Mikroskop-Objektträger, einer Cytospin Filter mit einem oder zwei Löcher und ein Zytospin Trichter in eine Zytospin Dia-Clip eingefügt. Die Dia-Clip wird geschlossen und in das Zytospin Rotor. </li><li> Die dissoziierten Zellsuspension wird durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren homogenisiert. Hinweis: Je nach Entwicklungsstadium der Netzhaut, kann die Zellsuspension aus der Dissoziation Verfahren müssenmit PBS verdünnt werden, um eine zählbare Anzahl von Zellen zu erhalten. </li><li> Ein Aliquot (100 ul) der Zellsuspension auf einen Zytospin Trichter eingesetzt. Hinweis: Beim Pipettieren der Zellsuspension auf den Trichter, die Spitze der Pipette sollte den ganzen Weg bis hinunter auf den Boden des Trichters. Es ist wichtig, nicht durch die zweite Druckpunkt der Pipette drücken, da dies schafft Luftblasen, die sichtbar in der Zelle vor Ort wird nach der Zytospin und behindert Zellzahlen. </li><li> Die Zellsuspension wird auf einer Folie bei 700 rpm für 7 min gesichtet. </li><li> Zur Bestimmung der Wirkung von exogen applizierten Faktoren auf die Apoptose Ebenen Zellen mit 4 angefärbt werden &#39;,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 2μg/ml), mit fluoreszierenden Eindeckmedium montiert. Änderungen in Apoptose kann durch Zählen mindestens 1000 Zellen (mindestens 10 pycnotic Kerne) in die Zelle Zytospin Flecken und der Zelltod-Rate wird als Prozentsatz der gesamten Zellen berechnet zählt 3,4 ermittelt werden. Hinweis: Alternativ kann die Verteilung der apoptotischen Kernen können in flatmounts 3 oder Kryostat sections4 von kultivierten retinalen wholemounts durch TdT-vermittelte dUTP nick end labeling (TUNEL) ausgewertet werden. </li><li> Für den Nachweis der Zellproliferation, können BrDU (5 pM) zugesetzt 6h vor dem Ende der Kultur und der BrdU-Einbau visualisiert in Cytospins von Zellhomogenaten durch immunzytochemische Färbung mit einem Anti-BrdU-Antikörper (zB Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, USA) werden. </li><li> Die Auswirkung der Behandlung auf verschiedenen retinalen Zelltypen können in Cytospins visualisiert Neuron-spezifischen Antikörpern wie Brn3a (Ganglienzelle Marker) oder Opsin (Photorezeptor Marker) und Gegenfärbung mit DAPI. </li></ol> Teil 7: Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Schritte zur Vorbereitung der murinen organotypischen Retina wholemounts Ein Leiter der Maus mit beiden Augen. B Murine Auge mit Linse nach oben, alle Schichten noch an seinem Platz. C Murine Auge von der Rückseite mit dem Sehnerv noch beigefügt. D Murine Auge mit Sklera und Pigmentepithel teilweise entfernt. E Murine Netzhaut mit Cornea, Sklera und Pigmentepithel vollständig entfernt, sondern Linse und Glaskörper noch an seinem Platz. F Murine Netzhaut wholemount Tasse mit Linse und Glaskörper entfernt. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Analyse der organotypischen Retina wholemount Kulturen Zytospin und Abschnitte Für die Analyse der Apoptose, sind Cytospins dissoziierter Zellsuspensionen durch DAPI gefärbt und pycnotic Kerne durch nukleare Fragmentierung oder Chromatinkondensation unterschieden werden (Pfeilspitzen in A). Alternativ wholemount Abschnitte (CE; murine Netzhaut postnatalen Tag (P) 2) oder retinalen Flatmount (F) kann mit einem TUNEL-Assay unterzogen werden und Gegenfärbung mit DAPI (E). Die Auswirkung der Behandlung auf verschiedenen retinalen Zelltypen können in Cytospins visualisiert Neuron-spezifischen Antikörpern wie die Ganglienzellen Marker Brn3a (Pfeile in B) GCL, Ganglienzellschicht;. INL, prospektiven inneren Körnerschicht. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

Der Vorteil der murine organotypischen Retina wholemount Kulturen 2-5 über Dissoziation, Monolayer, retinospheroid oder re-aggregiert 3D Sphäroid Kulturen 1 liegt in der Erhaltung der neuronalen Interaktionen und Verbindungen, imitiert die in vivo Situation. Im Vergleich zu früheren Berichten 2, bietet unser Video Artikel eine ausführliche Demonstration der Besonderheiten in Enukleation murine Augen und Dissektion der Netzhaut von verschiedenen Entwicklungsstadien einschlie?...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

Gezielte Ablationen von Genen und Analyse von Tiermodellen ist die klassische Strategie für die Einschreibung spezifische retinale Genfunktion. Allerdings transgenen, Retina-spezifische oder Knockout-Mausmodelle zeigen oft schon Letalität oder an einer schweren Fehlbildungen, verhindern eine Analyse über die embryonalen oder frühen postnatalen Stadien. Primäre Zellkultur ist eine Alternative zu den Auswirkungen der exogen applizierten rekombinanten Faktoren, die Überexpression von Genen oder siRNA-vermittelten Gen-Knockdown in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen. Dissoziierten Zellkultur hat den Vorteil, dass das körpereigene Signale erreichen die Zielzellen reduziert werden, wodurch auch die Identifikation von exogen ausgelöst Wirkungen nach pharmakologischen Manipulation. Allerdings sind wichtige Zell-Zell-Interaktionen zunächst durch enzymatische Verdauung oder mechanische Dissoziation zerstört, auch wenn re-aggregiert retinospheroid Kulturen 1 verwendet werden. Im Gegensatz dazu bieten organotypischen Retina wholemount Kulturen ein System in der Nähe der physiologischen in vivo Situation mit neuronalen Interaktionen und Verbindungen noch erhaltenen 2-5. In diesem Video-Artikel bieten wir Ihnen eine Schritt für Schritt Demonstration (1) die Einrichtung von in vivo-ähnlichen organotypischen Retina wholemount Kulturen einschließlich Dissektion Besonderheiten der embryonalen, postnatalen und adulten murinen Augen und (2) eine Dissoziation und Zytospin Verfahren zur Analyse von neuronalen Apoptose und retinalen Zell-Proliferation in organotypischen wholemounts nach Kultur in Gegenwart von exogen applizierten rekombinanten Faktoren wie zB.

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In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Dieses Video Artikel veranschaulicht die Einrichtung von organotypischen Retina wholemount Kulturen und einer Cytospin Verfahren zur Analyse von exogen induzierten Effekte. Organotypischen Retina wholemount Kulturen imitieren die<em&gt; In vivo</em&gt; Situation und deutlich erleichtern die Zugänglichkeit von murinen Retina für experimentelle Manipulationen unter Umgehung der Nachteile der klassischen Maus-Tiermodell.

In vivo-ähnlichen Organotypische Murine Retinal Wholemount Kultur

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

in-vivo-like-organotypic-murine-retinal-wholemount-culture

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

17.7K Aufrufe.  University of Duisburg-Essen. Dieses Video Artikel veranschaulicht die Einrichtung von organotypischen Retina wholemount Kulturen und einer Cytospin Verfahren zur Analyse von exogen induzierten Effekte. Organotypischen Retina wholemount Kulturen imitieren die In vivo Situation und deutlich erleichtern die Zugänglichkeit von murinen Retina für experimentelle Manipulationen unter Umgehung der Nachteile der klassischen Maus-Tiermodell.

Serie: In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Organotypischen Kultur der Adult Kaninchen Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Forschung

Biologie

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Organotypischen Kultur der E18 Gehirn von Ratten

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...