Die Autoren danken Lynne Foster für die technische Unterstützung bei Infektionsexperimenten, James Fitzpatrick vom Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) für den Zugang zum SEM, Scott Hultgren für den UTI89kanR UPEC-Stamm und David Hunstad für die kritische Lektüre des Manuskripts.
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), vom Center for Women's Infectious Disease Research an der Washington University School of Medicine (Pilot Research Award an NMG), von der American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) und #14POST20020011 (NMG) und von den National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) und NIDDK unterstützt: R21 DK092586 (ALLE), P50 DK064540-11 (SJH, Projekt II PI:ALL) und K01 DK110225-01A1 (NMG). Einige der Tierversuche wurden in einer Einrichtung durchgeführt, die durch den NCRR-Zuschuss C06 RR015502 unterstützt wurde. Das Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; wo SEM durchgeführt wurde) und MSJ wurden von der Washington University School of Medicine, dem Children's Discovery Institute der Washington University und dem St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), der Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) und dem National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie haben.

Der erste kritische Schritt in diesem Modell, um Mäuse zu identifizieren, die UPEC-Bakterien während der primären UTI-Phase nicht beseitigt haben. Diese Mäuse müssen aus dem Experiment entfernt werden, da sie sonst die Raten der UPEC-Bakteriurie nach der Exposition von G. vaginalis verwirren würden. Nach der ersten UPEC-Impfung sollte wöchentlich Urin gesammelt werden, um die bakterielle Clearance zu überwachen. Etwa 65-80% der C57BL/6-Mäuse werden eine UTI89-kanR-Infektion innerhalb von 4 Wochen beseitigen. Andere Inzuchtmäusestämme haben unterschiedliche Neigungen zur UPEC-Clearance42,43 und zur Reservoirbildung und sind daher möglicherweise nicht für dieses Modell geeignet. Der zweite kritische Punkt ist, dass empirische Studien festgestellt haben, dass zwei aufeinanderfolgende Impfungen von G. vaginalis (entweder 12 h oder 1 Woche auseinander) notwendig sind, um eine signifikante Reservoiremergenz über dem spontanen Hintergrundauftreten auszulösen, das bei Kontrollmäusen auftritt, die nur PBS ausgesetzt sind. Andere Zeiträume zwischen den beiden sequentiellen Expositionen wurden nicht getestet, könnten aber zu ähnlichen Ergebnissen führen. Es ist wichtig zu beachten, dass eine Reduktion der UPEC-Blasentiter nur in dem Modell beobachtet wurde, in dem G. vaginalis-Expositionen 1 Wochen auseinander39 verabreicht wurden. Während mehr als zwei Expositionen verabreicht werden können, deuten empirische Beweise darauf hin, dass eine wiederholte Katheterisierung allein die Emergenz erhöht, was die Interpretation der Ergebnisse verwirren kann oder eine größere Anzahl von Tieren erfordert, um Unterschiede zwischen Expositionsgruppen und Kontrollen zu unterscheiden. Schließlich hat die In-situ-Blasenfixierungsmethode mehrere kritische Schritte. Etwas Geschick ist erforderlich, um sicherzustellen, dass das Fixiermittel in den geklemmten Blasen verbleibt. Entleerte Blasen werden von REM schwieriger abzubilden sein. Es ist auch wichtig, sehr sanft zu sein, wenn das Fixiermittel in die Blase geimpft wird, da das Abkratzen des Urothels mit dem fixativ enthaltenden Katheter ein Urothelpeeling unabhängig von dem, was durch G. vaginalis ausgelöst wird, induzieren kann. Alle im fixativen Cocktail genannten Konzentrationen sind Endkonzentrationen. Unsachgemäße Verhältnisse von diesen können zu unzureichender Fixierung und Schwellung oder Schrumpfung der Zellen führen. Fixiermittel sollten auf physiologische Temperaturen erwärmt werden, um Temperaturschocks in Zellen und Geweben zu vermeiden. Die Erwärmung bietet auch eine leichte Verbesserung der Diffusionsrate von Fixiermitteln durch Plasmamembranen. Während die Osmiumfärbung bei Proben, die für die REM-Analyse vorbereitet wurden, oft weggelassen werden kann, ist es ein wesentlicher Schritt in diesem Protokoll, um Lipide zu stabilisieren und das Reißen von Zellmembranen während der kritischen Punkttrocknung zu verhindern.
Dieses Protokoll kann modifiziert werden, um andere UPEC- und/oder G. vaginalis-Stämme auf ihre Fähigkeit zu testen, Reservoirs zu bilden bzw. ihre Entstehung auszulösen. Andere experimentelle Faktoren können ebenfalls hinzugefügt werden, wie die Exposition gegenüber anderen vaginalen Bakterien (z. B. Lactobacillus crispatus PVAS100) oder hitzeabgetötetes G. vaginalis, von denen keiner in diesem Modell39 eine Pathologie zeigt. Bei der Auswahl anderer zu testender Bakterienstämme ist es wichtig, ein konsistentes Wachstum nachzuweisen, so dass in allen Experimenten eine Standard-Inokulumkonzentration verwendet werden kann. Das Wachstum von JCP8151BSmR wurde in einer anaeroben Kammer optimiert. Dieser Stamm könnte wahrscheinlich in einem anaeroben GasPak-System kultiviert werden, aber dies würde eine Optimierung erfordern, um ein robustes Bakterienwachstum zu gewährleisten. Schließlich kann es möglich sein, das Timing bestimmter Schritte im Modell zu ändern. Zum Beispiel kann Urin zu früheren Zeitpunkten während der UPEC-Reservoirbildungsphase gesammelt werden, um die Reaktionen von CFU oder Wirt zu überwachen. Eine nachteilige Wirkung der Entnahme von Urinproben zu frühen Zeitpunkten (3, 6, 12 hpi) auf das Fortschreiten der Infektion oder die Etablierung von Reservoirs wurde in diesem Modell nicht beobachtet. Es wurde berichtet, dass das Auftreten von UPEC-Reservoirs nach zwei JCP8151BSmR-Dosen mit 12 h oder 1 Woche auftritt, aber andere Zeitintervalle wurden noch nicht getestet. Es kann auch möglich sein, die Gesamtdauer für das Modell zu reduzieren, indem die UPEC-Reservoirbildungsphase auf 2 Wochen (statt 4 Wochen) reduziert wird, da viele der Mäuse zu diesem Zeitpunkt Bakterien beseitigen. Frühere Studien, in denen die UPEC-Entstehung nach Blasenexposition gegenüber chemischen Peelings untersucht wurde, verwendeten eine 1- oder 2-wöchige UPEC-Reservoirbildungsphase17,18. Die Verkürzung der Zeit für die UPEC-Bakteriurie-Clearance kann jedoch auf Kosten der Notwendigkeit gehen, mehr Tiere aus dem Versuch zu keulen. Schließlich kann die REM-Analyse der Blase zu zusätzlichen Zeitpunkten durchgeführt werden, um die Dauer der Wirkung von G. vaginalis auf das Urothel zu beobachten.
In Bezug auf die Fehlerbehebung gibt es einige wichtige Überlegungen speziell in Bezug auf die Blasen-SEM-Analyse. Abhängig vom verwendeten Maushintergrund und der Menge der vorhandenen Entzündung weisen einige Blasen sehr dünne Wände auf. Diese Blasen neigen dazu, sich während der kritischen Punkttrocknung stärker zu kräuseln und können zu einer kaurimuschelartigen Form führen. In diesem Fall ist die beste Methode, die schalenförmige Blase entlang der gekräuselten Grenzfläche in zwei Hälften zu schneiden und dann ein zweites Mal den Großteil des überhängenden Gewebes zu entfernen. Das Schneiden funktioniert am besten mit einer PTFE-beschichteten zweischneidigen Rasierklinge. Überschüssiges Fett kann manchmal während der Osmium-Färbeschritte auflösen. Dies kann zu unerwünschten unlöslichen Fetttröpfchen führen, die sich während der Spül- und Dehydratisierungsschritte möglicherweise nicht abwaschen und sich während der anschließenden Trocknung auf der Blasenoberfläche absetzen können. Diese Tröpfchen können entweder als kleine Kugeln oder als scheibenartige Strukturen auftreten, die über die Probe verstreut sind (Abbildung 4D). Dies kann gemildert werden, indem sichergestellt wird, dass so viel Fettgewebe wie möglich aus der Nähe der Blase entfernt wird. Platin kann durch Iridiumbeschichtung ersetzt werden, aber Dicken sollten auf ein Minimum beschränkt werden, um die Maskierung feiner Strukturdetails zu reduzieren. Die Verwendung eines rotierenden Tisches während der Beschichtung wird dringend empfohlen.
Eine Einschränkung dieses Modells besteht darin, dass es eine große Anzahl von Mäusen benötigt. Nur 65-80% der C57BL/6-Mäuse werden ihre UPEC-Bakteriurie beseitigen und für eine nachfolgende G. vaginalis- oder PBS-Impfung geeignet sein (siehe Abbildung 2C). Um 10-12 Mäuse pro Gruppe (G. vaginalis-Impfung vs. PBS) zu erhalten, sollten ~ 30 Mäuse zunächst mit UPEC infiziert werden. Darüber hinaus sind wahrscheinlich mehrere Experimente erforderlich, um die biologischen Replikate zu erreichen, die zum Nachweis der statistischen Signifikanz erforderlich sind. Wenn die Expositionen im Abstand von 1 Woche verabreicht wurden, trat bei 14 % der Mäuse, die PBS ausgesetzt waren, ein UPEC-Auftreten auf (Abbildung 3B). Daher erfordert der Nachweis eines signifikanten Anstiegs des UPEC rUTI bei G. vaginalis-exponierten Mäusen im Vergleich zu PBS-Kontrollen (mit einer Leistung von 0,8; alpha=0,05 [einseitig]) das Testen einer kumulativen Gesamtzahl von mindestens 40 Mäusen für jede Expositions-Gruppe. Eine weitere Überlegung ist, dass diese Experimente teuer und arbeitsintensiv sind. Mäuse müssen wöchentlich auf UPEC-Clearance überwacht werden und der experimentelle Zeitverlauf beträgt 4-5 Wochen, je nachdem, ob G. vaginalis zweimal in einem Zeitrahmen von 12 Stunden oder zweimal im Abstand von 1 Woche verabreicht wird. SEM ist arbeitsintensiv und kann je nach Verfügbarkeit des Mikroskops und Servicegebühren teuer sein. Die Vorbereitung der gesamten Blase für SEM bietet reichlich Material für die Analyse, aber der Nachteil ist, dass die Analyse jeder Blase zeitaufwendig sein kann. Daher ist es wahrscheinlich, dass nur eine begrenzte Anzahl von Blasen von REM analysiert werden kann, verglichen mit den höheren Tierzahlen, die für Urin- und Gewebetiter verwendet werden. Darüber hinaus erfordert das Erhalten hochwertiger Bilder der gekrümmten Oberflächen der Blasen-"Tassen" Geschick aufgrund von Schatten, die die Sicht beeinträchtigen können. Obwohl Blasen-REM ein nützliches Werkzeug zur Visualisierung des Urothel-Peelings ist, ist diese Methode weitgehend qualitativ. Da die Probe in runder Form fixiert ist und aufgrund der Verwendung von Glutaraldehyd im Fixiermittel ein Screening auf fluoreszierend exprimierende Bakterien mittels Lichtmikroskopie nicht möglich ist. Immunfärbende und chemische Farbstoffe sind mit diesem Prozess aufgrund der Verwendung von Glutaraldehyd, das die meisten Antigene und Osmium vernetzt und die Antigenstellen maskiert und das Gewebe verdunkelt, nicht kompatibel. Allerdings ist die REM-Technik nützlich für Parameter, die quantitativ ohne den Einsatz zusätzlicher Sonden ausgewertet werden können, wie z.B. die Zellgröße48,49.
Dieses Modell bietet mehrere Vorteile, die über die zuvor beschriebenen Methoden hinausgehen. Es ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen von UPEC rUTI, die durch das Auftauchen aus Blasenreservoirs verursacht werden, im Gegensatz zur Wiedereinführung aus einer externen Quelle in die Blase. Andere Modelle von rUTI aufgrund des Auftretens aus Blasenreservoirs verwenden chemische Mittel (Protaminsulfat oder Chitosan), um ein Urothelpeeling zu verursachen17,18, das bei Frauen keine Auslöser von rUTI wäre. G. vaginalis ist ein weit verbreitetes urogenitales Bakterium, das im Urin nachgewiesen wurde, der direkt aus der Blase durch Katheterisierung oder suprapubische Aspiration bei einigen Frauen23,26 gesammelt wurde. Diese Tatsache, gepaart mit der bekannten Assoziation zwischen BV (bei der G. vaginalis in der Vagina überwächst) und UTI, deutet darauf hin, dass G. vaginalis ein klinisch plausibler Auslöser von rUTI ist. Schließlich bewahrt die In-situ-Blasenfixierungsmethode die Blasenultrastruktur und begrenzt Schäden, wodurch sichergestellt wird, dass sich die Blasenschichten nicht voneinander trennen. Frühere Methoden zur Visualisierung des Urothels haben den Benutzer traditionell dazu gebracht, die Blase aseptisch zu ernten, zu halbieren, zu dehnen und auf eine Dissektionsschale zu stecken, bevor er die gestreckte Blase in Fixiermittel48 eintaucht. Diese Methode führt zu einer sehr flachen Probe, gewährleistet jedoch keine gleichmäßige oder natürliche Dehnung des Gewebes und kann zu Bereichen führen, die über- und unterdehnt sind (was zu stark faltigem Gewebe führt) und eine Trennung der Blasenschicht verursachen können. Darüber hinaus können diese physikalischen Manipulationen der Blase, um das Gewebe zu dehnen und zu fixieren, Schäden verursachen, einschließlich Urothelpeeling. Eine andere Methode besteht darin, intakte Blasen in Fixiermittel zu tauchen, bevor sie in Paraffin eingebettet werden und dünne Abschnitte mit einem Mikrotom aufnehmen. Dünne Schnitte sind für immunhistochemische Experimente von unschätzbarem Wert, um die Lokalisation von Bakterien und Wirtsproteinen zu untersuchen, aber ein dünner Schnitt erlaubt keine Visualisierung der Urotheloberfläche. Mit dieser REM-Methode kann die Oberfläche der gesamten Blase auf einmal untersucht werden.
Wie beschrieben, umfassen zukünftige Anwendungen dieses Modells das Testen anderer UPEC-Stämme, um festzustellen, ob sie intrazelluläre Reservoirs bilden, und das Testen anderer G. vaginalis-Stämme , um zu beurteilen, ob sie ein Peeling und UPEC-Emergenz auslösen, um rUTI zu verursachen. Andere Mausstämme jenseits von C57BL/6-Mäusen können ebenfalls getestet werden, obwohl Mäuse mit einer hohen Neigung zur Entwicklung einer chronischen Blasenentzündung (wie Mäuse auf dem C3H-Hintergrund) nicht empfohlen werden, da zu viele Mäuse aus dem Experiment aussortiert werden müssten. Ein weiterer Vorteil von C57BL/6-Mäusen ist, dass viele genetische Knockout-Stämme im Handel erhältlich sind. Solche Stämme bieten die Möglichkeit, die Wirtsfaktoren zu hinterfragen, die an der Reservoirbildung und/oder -entstehung beteiligt sind.

Harnwegsinfektionen (UTI) stellen weltweit eine erhebliche Belastung für die Gesundheitsversorgung dar und beeinträchtigen jedes Jahr die Lebensqualität von Millionen von Menschen, insbesondere von Frauen,1. Uropathogene Escherichia coli (UPEC) sind die häufigste Ursache fürHarnwegsinfektionen 1. Viele Patienten (ca. 20-30%), die eine Harnwegsinfektion entwickeln, werden trotz antibiotikavermittelter Clearance der Erstinfektion innerhalb von 6 Monaten eine rezidivierende Harnwegsinfektion (rUTI) erleben2. Leider leiden bis zu 5% der prämenopausalen Frauen jedes Jahran 3 oder mehr rUTI 3,4. Sequenzielle Episoden von rUTI können durch Persistenz desselben UPEC-Stammes aus dem Indexfall 5,6,7,8 verursacht werden. Daten aus menschlichen Proben und Mausmodellen deuten darauf hin, dass rUTI mit gleichem Stamm durch UPEC verursacht werden könnte, die sich in ruhenden Reservoirs in der Blase befindet. Beim Menschen wurden UPEC in Epithelzellen und Blasenbiopsien von Patienten mit Harnwegsinfektionen 9,10,11,12,13 nachgewiesen. Studien an C57BL/6-Mäusen haben gezeigt, dass einige UPEC-Stämme ruhende intrazelluläre Reservoirs in der Blase aufbauen können, wie sie durch Fluoreszenzmikroskopie und durch Homogenisierung und Kultur von Blasengewebe nachgewiesen wurden, die monatelang nach Auflösung der Bakteriurie14,15,16 aufrechterhalten werden. Die Behandlung der Blase mit Mitteln, die ein Peeling des Blasenepithels (Urothel) induzieren, z. B. Protaminsulfat17 oder Chitosan18, lösen das Auftreten von UPEC aus Reservoirs aus, um rUTI zu verursachen. Diese Daten deuten darauf hin, dass bei Frauen, die Blasen-UPEC-Reservoirs aus einer früheren Infektion beherbergen, Blasenexpositionen, die zu einem Urothelpeeling führen, rUTI auslösen können.
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die vaginale Mikrobiota zur Harnwegsinfektion beiträgt19,20. Gardnerella vaginalis ist ein häufiges Mitglied sowohl der vaginalen als auch der urinalen Mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. In der Vagina ist das Vorhandensein hoher G. vaginalis-Spiegel mit einer mikrobiellen Dysbiose verbunden, die als bakterielle Vaginose (BV) bekannt ist und ~ 30% der Frauen30,31,32 betrifft. Frauen mit BV haben ein höheres Risiko, an Harnwegsinfektionen zu erkranken, verglichen mit Frauen mit einer vaginalen Gemeinschaft, die von Lactobacillus33,34,35,36,37 dominiert wird. In Mausmodellen verursacht G. vaginalis ein epitheliales Peeling sowohl in der Vagina38 als auch in der Blase39. Bei C57BL/6-Mäusen, die UPEC-Blasenreservoirs beherbergen, führen zwei aufeinanderfolgende Blasenexpositionen gegenüber G. vaginalis - aber nicht gegenüber PBS - zu einem Wiederauftreten von UPEC aus Reservoirs, um UPEC rUTI zu verursachen. Das Auftreten wird durch das Auftreten von UPEC-Titern im Urin von Mäusen belegt, die zuvor die UPEC-Bakteriurie aufgelöst hatten, und eine anschließende Abnahme der UPEC-Blasenhomogenattiter bei der Aufopferung im Vergleich zu PBS-exponierten Kontrolltieren39. Interessanterweise gibt es keine dauerhafte Besiedlung durch G. vaginalis in der Blase. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle reichen zwei kurze Expositionen mit jeweils weniger als 12 (h) lebensfähigem G. vaginalis im Urin aus, um ein urotheliales Peeling auszulösen und die rUTI zu fördern.
Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell von rUTI, das durch UPEC verursacht wird, das sich in intrazellulären Blasenreservoirs befindet, wobei die Blasenimpfung von G. vaginalis verwendet wird, um das Wiederauftreten auszulösen. Der Fortschritt, den dieses Modell erzielt, besteht darin, dass G. vaginalis im Vergleich zu bisher verwendeten chemischen Mitteln ein klinisch relevanter biologischer Auslöser von rUTI ist. Darüber hinaus ermöglicht das relativ kurzlebige Überleben von G. vaginalis in den Harnwegen der Maus die Untersuchung der Auswirkungen vorübergehender mikrobieller Expositionen auf das Urothel, wie sie nach sexueller Aktivität auftreten könnten. Neben der Skizzierung des rUTI-Modells beschreibt dieses Protokoll auch Methoden zur Urinzytologie und in situ Blasenfixierung und Bildgebung des Urothels mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM).
Dieses Protokoll der G. vaginalis-induzierten rezidivierenden UPEC UTI verwendet den UPEC-Stamm UTI89 mit einer Kanamycin-Widerstandskassette (UTI89kanR)40. Nicht alle getesteten UPEC-Stämme waren in der Lage, während des akuten Infektionsstadiums bei Mäusen 41 intrazelluläre Bakteriengemeinschaften zu bilden, und es ist noch nicht bekannt, ob alle UPEC-Stämme die Fähigkeit haben, latente intrazelluläreReservoirs zu bilden. Die Reservoirbildung sollte vor der Verwendung anderer UPEC-Stämme im Modell bestätigt werden. Dieses Protokoll verwendet ein spontanes Streptomycin-resistentes G. vaginalis-Isolat, JCP8151BSmR38. Die Induktion von rUTI durch JCP8151BSmR erfordert zwei aufeinanderfolgende G. vaginalis-Impfungen, die entweder 12 h oder 7 Tage (d) im Abstandvon 39 gegeben sind. Ob andere G. vaginalis-Stämme ein Peeling und/oder UPEC rUTI induzieren, muss mit diesem Modell noch bestimmt werden. Es ist wichtig, UPEC- und G. vaginalis-Stämme mit bekannter Antibiotikaresistenz (wie Kanamycin oder Spectinomycin für UPEC und Streptomycin für G. vaginalis) zu verwenden, da Antibiotika zu Agarplatten hinzugefügt werden können, um das Wachstum endogener Mausmikrobiota zu verhindern, die sonst die Aufzählung koloniebildender Einheiten (CFU) zur Überwachung der Infektion stören könnten. Dies ist besonders wichtig für die Kultivierung von Urinproben, da Mausurin häufig andere Bakterien enthält, die ohne Antibiotika auf Kulturplatten überwachsen können. Der Ursprung dieser endogenen Bakterien im Mausurin ist unbekannt, spiegelt aber wahrscheinlich periurethrale und urogenitale Bakterien wider, die während der Urinsammlung aufgenommen wurden.
G. vaginalis ist ein fakultatives anaerobes Bakterium und daher beschreibt dieses Protokoll den Anbau von G. vaginalis JCP8151BSmR in einer anaeroben Kammer. Wenn keine anaerobe Kammer verfügbar ist, können andere Methoden zur Aufrechterhaltung anaerober Wachstumsbedingungen (z. B. ein GasPak-Beutel in einem luftdichten Behälter) verwendet werden. Alternativ wachsen einige Stämme von G. vaginalis (einschließlich JCP8151B SmR) in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator (5% CO2). So wie die Verwendung anderer G. vaginalis-Stämme als JCP8151BSmR Tests erfordert, um sicherzustellen, dass sich die Bakterien in diesem Modell ähnlich verhalten, erfordert die Änderung der Wachstumsbedingungen eine empirische Bestimmung der idealen Dauer für Kultur (auf Platten und in Flüssigkeit) und optische Dichte (OD) 600-Äquivalente, um die gewünschten lebensfähigen Inokulumkonzentrationen zu erreichen. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob die Wachstumsbedingungen die Pathobiologie von G. vaginalis beeinflussen.
Schließlich sollten sich die Forscher bei der Überlegung, ob dieses Modell verwendet werden soll, bewusst sein, dass es eine größere Anzahl von Tieren pro Gruppe erfordern kann als typische UTI-Mausmodelle. Dies liegt zum Teil daran, dass die Induktion von rUTI erfordert, dass die Mäuse die durch die Erstinfektion der Blase verursachte UPEC-Bakteriurie auflösen. Daher ist jede Maus, die keine Bakteriurie (ein Phänotyp, der normalerweise auf eine anhaltende Niereninfektion hinweist) nicht in die rUTI-Phase des Protokolls einbezogen. Die Anzahl der Mäuse, die benötigt werden, um diese Studien durchzuführen, wird auch durch die Rate des "spontanen" UPEC-Auftretens in den Urin beeinflusst (durchschnittlich 12-14%). Schließlich haben verschiedene Mausstämme unterschiedliche Neigungen zur Entwicklung chronischer Bakteriurie im Vergleich zur intrazellulären Reservoirbildung42,43. Bei Verwendung anderer Mausstämme als C57BL/6 in diesem Modell muss bestätigt werden, dass die Tiere ruhende intrazelluläre UPEC-Reservoirs entwickeln.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

Rezidivierende Harnwegsinfektionen (rUTI), die durch uropathogene Escherichia coli (UPEC) verursacht werden, sind häufig und kostspielig. Frühere Artikel, die Modelle der Harnwegsinfektion bei männlichen und weiblichen Mäusen beschreiben, haben die Verfahren zur bakteriellen Inokulation und Aufzählung in Urin und Gewebe veranschaulicht. Während einer anfänglichen Blaseninfektion bei C57BL/6-Mäusen etabliert UPEC latente Reservoirs in Blasenepithelzellen, die nach Clearing der UPEC-Bakteriurie bestehen bleiben. Dieses Modell baut auf diesen Studien auf, um rUTI zu untersuchen, die durch das Auftreten von UPEC aus latenten Blasenreservoirs verursacht werden. Das urogenitale Bakterium Gardnerella vaginalis wird in diesem Modell als Auslöser von rUTI verwendet, da es häufig in den urogenitalen Trakten von Frauen vorhanden ist, insbesondere im Zusammenhang mit vaginaler Dysbiose, die mit Harnwegsinfektionen in Verbindung gebracht wurde. Darüber hinaus wird eine Methode zur In-situ-Blasenfixierung mit anschließender Rasterelektronenmikroskopie (REM) der Analyse des Blasengewebes beschrieben, mit einer möglichen Anwendung auf andere Studien mit der Blase.

Nach der Impfung sind UPEC-Titer im Urin nachweisbar (Abbildung 2B). Das Versäumnis, Urinproben auf selektiven Medien zu platten, die Kanamycin enthalten, wird wahrscheinlich zu einem Überwachsen der endogenen Mausmikrobiota führen, die den Urin kontaminiert. Das Niveau der UPEC-Bakteriurie wird wahrscheinlich an Tag 1 hoch sein und kann in der ersten Woche ansteigen, bevor es zu späteren Zeitpunkten abnimmt (Abbildung 2C). Etwa 65-80% der Mäuse haben bei 28 dpi keine nachweisbare UPEC im Urin (Abbildung 2C, grüner Kreis). Diese Mäuse können in den nachfolgenden Schritten des Modells verwendet werden. Mäuse, die bakteriell bleiben (Abbildung 2C, rote Ellipse), sollten aus dem Experiment eliminiert werden.
Zwei aufeinanderfolgende G. vaginalis-Expositionen im Abstand von 12 h (Abbildung 3A) oder 1 Woche (Abbildung 3B) führen zur Entstehung von UPEC aus intrazellulären Reservoirs, um rezidivierende Bakterien zu verursachen. Sowohl der Spiegel der UPEC-Bakteriurie (Mann-Whitney-Test) als auch der Anteil der Mäuse, die UPEC rUTI (Fishers exakter Test) aufweisen, sind bei Mäusen, die G. vaginalis ausgesetzt sind, im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe signifikant höher. Die zytologische Urinanalyse weist PMNs im Urin von G. vaginalis-exponierten Mäusen nach, die UPEC-Emergenz zeigten (Abbildung 3C). In dem Modell mit zwei Expositionen im Abstand von 1 Woche sind die UPEC-Titer im Blasengewebe bei G. vaginalis-exponierten Mäusen im Vergleich zu PBS niedriger (Abbildung 3D), vermutlich aufgrund des Auftretens von UPEC aus Reservoirs und der anschließenden Clearance.
Die Visualisierung von in situ fixiertem Blasengewebe durch REM zeigt große oberflächliche Umbrella-Urothelzellen, die die Blasenoberfläche bei Kontrollmäusen auskleiden, die nur PBS ausgesetzt sind (Abbildung 4A). Das urotheliale Peeling wird durch einen Verlust oberflächlicher Schirmzellen nachgewiesen, die bei Mäusen, die G . vaginalis ausgesetzt sind, kleinere darunter liegende Übergangsepithelzellen freilegen (Abbildung 4B). Früh nach der UPEC-Inokulation während der Etablierung intrazellulärer Reservoirs sind UPECs auf dem Urothel sichtbar und filamentieren aus Peelingzellen (Abbildung 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Abbildung 2. Überwachung der UPEC-Titer im Urin während der Phase 1 (Reservoirbildung). (A) Schematische Darstellung der Beschichtung von koloniebildenden Einheiten (KBE). (B) Repräsentatives Bild von UPEC-Titern im Urin auf LB+Kanamycin. Schwarze Kreise zeigen Urinprobenflecken an, die gezählt werden sollten, um CFU/ml zu berechnen. (C) Zeitlicher Verlauf der UPEC-Bakteriurie bei C57BL/6-Mäusen. Jede Linie stellt eine einzelne Maus dar, die die UPEC-Urintiter im Laufe der Zeit verfolgt. Die gepunktete Linie zeigt die Nachweisgrenze (1000 KBE/ml) an. Die rote Ellipse zeigt vier Mäuse (von 20) an, die die UPEC-Bakteriurie nicht auflösen konnten und daher nicht für das G. vaginalis-induzierte rUTI-Modell verwendet werden würden . Umgekehrt zeigt der grüne Kreis Mäuse an, die die UPEC-Bakteriurie auflösten und zu nachfolgenden Phasen übergingen. (D) Tabelle der Daten, die zur Erstellung von Schaubildern in Tafel C verwendet wurden. Gelbe, nachweisbare KBE; grün, keine KBE. (E) Randomisierung von Mäusen in Expositionsgruppen auf der Grundlage des Zeitpunkts, zu dem UPEC-CFU nicht mehr im Urin nachgewiesen wurden ("Tag aufgelöst"). Die Mausnummern in der linken Spalte von Bedienfeld D sind die gleichen Mausnummern, die in Bedienfeld E angegeben sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Abbildung 3. G. vaginalis löst UPEC rUTI aus. UPEC-Titer im Urin nach zwei aufeinanderfolgenden Harnwegsexpositionen bei PBS (Kreise) oder G. vaginalis (Gvag; Quadrate) im Abstand von 12 h (A) oder 1 Woche (B). Jedes Symbol steht für eine einzelne Maus. Die höchste CFU/ml UPEC, die von jeder Maus zwischen 1-3 d nach der zweiten Exposition nachgewiesen wurde, werden aufgetragen. Mäuse ohne nachweisbare Bakterien werden an der Nachweisgrenze (gepunktete Linie) aufgetragen. (C) Urinzytologische Analyse mit UPEC- (Pfeilspitzen) und polymorphkernigen (PMN) Zellen (Pfeile). Maßstabsleiste = 20 μm. (D) UPEC-Titer im Blasengewebe, die 3 d nach zwei aufeinanderfolgenden Harnwegsexpositionen im Abstand von 1 Woche gesammelt wurden. Jedes Symbol steht für eine andere Maus und Nullen werden an der Nachweisgrenze (gepunktete Linie) dargestellt. In A, B und D befinden sich die Kästchen im ersten und dritten Quartil, wobei der Median markiert ist und die Schnurrhaare von min bis max. Mann-Whitney U Tests * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Abbildung 4. REM-Analyse von in situ fixierten Blasen. Blasen wurden von Mäusen 3 h nach zwei Expositionen (im Abstand von 12 h) bei PBS (A) oder G. vaginalis (C) gesammelt. Gepunktete Linien zeigen eine einzelne Harnepithelzelle, die in G. vaginalis-exponierten Blasen kleiner ist, weil die großen oberflächlichen Zellen ein Peeling abblättern und das darunter liegende Übergangsepithel freilegen . (B) Die Blase wurde 6 h nach der ersten Inokulation mit UPEC während der Phase 1 des Modells gesammelt und zeigte ein urotheliales Peeling und extrazelluläre UPEC. (D) Beispiel für unlösliche Fetttröpfchen auf der Blasenoberfläche. Maßstabsbalken sind 20 μm in den Hauptbildern und 2 μm im Einschub. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Ein Mausmodell der uropathogenen transurethralen E. coli (UPEC) -Inokulation zur Etablierung latenter intrazellulärer Blasenreservoirs und einer anschließenden Blasenexposition gegenüber G. vaginalis zur Induktion einer rezidivierenden UPEC-Harnwegsinfektion ist nachgewiesen. Ebenfalls demonstriert werden die Aufzählung von Bakterien, die Urinzytologie und die In-situ-Blasenfixierung und -verarbeitung für die Rasterelektronenmikroskopie.

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

recurrent-escherichia-coli-urinary-tract-infection-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

5.7K Aufrufe.  Washington University School of Medicine in Saint Louis. Ein Mausmodell der uropathogenen transurethralen E. coli (UPEC) -Inokulation zur Etablierung latenter intrazellulärer Blasenreservoirs und einer anschließenden Blasenexposition gegenüber G. vaginalis zur Induktion einer rezidivierenden UPEC-Harnwegsinfektion ist nachgewiesen. Ebenfalls demonstriert werden die Aufzählung von Bakterien, die Urinzytologie und die In-situ-Blasenfixierung und -verarbeitung für die Rasterelektronenmikroskopie.

Serie: Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on Luria-Bertani (LB) agar at 37&deg;C in ambient air. UPEC strains grow as yellowish-white translucent colonies on LB agar. Following confirmation of appropriate colony morphology, single colonies are then picked to be cultured in broth. LB broth can be used for most uropathogenic bacterial strains. Two serial, overnight LB broth cultures can be employed to enhance expression of type I pili, a well-defined virulence factor for uropathogenic bacteria. Broth cultures are diluted to the desired concentration in phosphate buffered saline (PBS). Eight to 12 week old female mice are placed under isoflurane anesthesia and transurethrally inoculated with bacteria using polyethylene tubing-covered 30 gauge syringes. Typical inocula, which must be empirically determined for each bacterial/mouse strain combination, are 106 to 108 cfu per mouse in 10 to 50 microliters of PBS. After the desired infection period (one day to several weeks), urine samples and the bladder and both kidneys are harvested. Each organ is minced, placed in PBS, and homogenized in a Blue Bullet homogenizer. Urine and tissue homogenates are serially diluted in PBS and cultured on appropriate agar. The following day, colony forming units are counted.

This video will demonstrate methods to transurethrally induce mouse urinary tract infections and quantify the extent of resulting infections.

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Wiederkehrende Herpetic Stromakeratitis in Mäuse, ein Modell für das Studium der menschlichen HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion in der neonatalen Ratten

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.